DNA制备

真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。 常见的做法是在合成cDNA的双链 ...

互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。　　杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交 即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最 ...

EnzymeSupplied NEBuffer% Activity in NEBuffers1234Aat II405050100Acc I4505010100Acc65 I3 + BSA107510025Aci I3255010050Acl I4 + BSA10100100Afe I *SE-Y255025100Afl II2 + BSA5010025100Afl III3 + BSA25751 ...

单位定义 限制性内切酶的一个活性单位是指，在50μl 的反应体系里，采用随酶提供的 NEBuffer，用1个小时的时间，彻底消化1μg底物DNA所需要的酶量。 酶切反应应在带盖的Eppendorf 管中进行，选用技术数据卡上所标明的适宜温度。在确定酶活性之前，浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1000 单位/ml。 质量控制 所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。 非特异性内切酶 ...

蛋白和mRNA在细胞核和细胞质之间的运输称为入核和出核，它是维持细胞动态稳定的重要因素。这些细胞成分的进核、出核是蛋白合成、细胞增殖和细胞凋亡的关键步骤。这种运输需要一些其它蛋白因子的辅助并要求这些被运输物质上有一特定的可识别定位序列。入核信号称为核定位信号(NLS)，出核信号称为核输出信号(NES)。入核和出核在核孔复合物上发生，它是嵌在核膜上的超分子多肽复合物。小分子和离子是被动扩散的，而蛋 ...

分子生物学产品常见问题分析问题原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割1) 内切酶失活标准底物检测酶活性2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3) 条件不适（试剂、温度）检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基 ...

酶最适温度37°C%活性Apa I25°C10undefinedApeK I75°Cn/aApo I50°C50Bae I25°C20Bcl I50°C50BfuA I50°C25BpuE I25°C20Bsa I55°C10BsaB I60°C20BsaJ I60°C20BsaW I60°C20BsiE I60°C30BsiHKA I65°CBsiW I55°C50Bsl I55°C30Bsm I65°C20 ...

稀释限制性内切酶时，建议使用稀释缓冲液（A，B，C）。建议临用前稀释且稀释终浓度不要小于1000 units/ml。目录及说明书中标注了每一种内切酶相应的稀释兼容性。注：以下稀释液不适用于耐热DNA聚合酶。欲了解稀释耐热DNA聚合酶的相关情况，请参见相应章节。稀释缓冲液成份：稀释液A： 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl 0.1 mM EDTA 1 mM DTT 200 µg/ml ...

长时间反应时内切酶的活性保持情况因酶而异。本表中列出了在16小时内完全酶解底物DNA所需的最小酶量。实验方法：在50µl的反应体系中，分别加入1µg的单位定义底物DNA和1.00、0.50、0.25和0.13个单位的内切酶，37°C（或要求的最适温度）反应16小时。用琼脂糖凝胶电泳法来确定在16小时内酶解1µg底物DNA所需的最小酶量。16小时酶解1µg底物需要酶量小于1单位的酶可以用加入较少的 ...

热失活是终止酶切反应的一种简便易行的方法。大多数最适反应温度是37℃的酶在65℃下温育20分钟即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如将温度升高至80℃，温育20分钟也可失活。下表注明了每种酶的失活条件。在50μl的反应体系中，37℃条件下，以0.5μg小牛胸腺DNA作为底物，加入5-10μl内切酶及相应缓冲液，反应60分钟，然后升温至65℃或80℃温育20分钟进行热失活。在上述混合液中加入0.5 ...

在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（6、7）、P ...

同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲 ...

　腺病毒的一般特性 腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体（Stewart et al. 1993）。其病毒壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2（Fig. 1）。腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合（Rekosh et al. 1977），5’端上还具有 ...

自杀性质粒载体完全可以自己构建，只要保证两点：１，自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，也就是说载体上不能有能在宿主菌中复制的复制子；２，要由筛选标记． 自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制，否则会导致细菌染色体突变株的构建失败。但是在构建时，要注意以下方面：1。在制备质粒载体和DNA插入片断时：2ug 5kb大小的线状DNA大约含有1.4poml/L5'末端磷酸。5‘突出端脱磷需要CIP ...

核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组D ...

A. 吸附法 优点：做作条件温和、简便；成本低；载体可反复使用不足：对离子强度、pH、温度等因子敏感，故酶易损漏，且酶转载容量较小B.共价偶联法优点：载体与酶偶联的方法多样化；固定化的酶非常稳定，损漏少不足：偶联试剂对生命组织多有一定毒性；偶联条件激烈，易引起酶失效；成本较高C.交联法优点：可用的交联试剂多，技术简易；稳定性较高不足：交联条件较激烈，常出现扩散限制，使用有一定难度D.包埋法优点：可 ...

以下是所有的看家基因的列表，大家在设计引物时，可以直接采用这些基因的序列，本表来自于Trends in Gentics上一篇文献，内容全面，所有的看家基因均标注了基因银行号（Genbank），可以直接到pubmed中查询得出。引物设计可以推荐用primer 5，也可以直接与我们联系设计，有关事宜，请点击：http://www.bioon.net/service/meeting/200506/130 ...

生物大分子制备的前处理 生物大分子制备的前处理(生物材料的选择、细胞破碎、生物大分子的提取） 1生物材料的选择 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料，但往往这几方面的要求不能同时具备，含量丰富但来源困难，或含量来源较理想，但材料的分离纯化方法繁琐，流程很长，反倒不如含 ...

DNA重组技术（或基因工程）是20世纪生物学的伟大成就，并已渗透到生命科学包括医学 各个领域，为肿瘤的实验研究和临床诊断及治疗提供了崭新的技术和有用的工具。本附录扼要介绍在分子肿瘤学领域中常用的分子生物学基本技术及其在肿瘤研究中的应用，着重介绍它们的原理和应用。至于具体的技术方法和操作步骤可参阅《分子克隆实验指南》（第二版，科学出版社，1992年）等实验指导。 一、常用的分子生物学基本技术核酸分子 ...

IS PCR的技术特点 （1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。 IS PCR的基本方法 IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA ...