抗原设计

PCR扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因 在B细胞发育过程中V―D―J的重排可导致某些核苷酸的随机缺失或插入。因此不同的B细胞克隆经PCR后产生的扩增片段长短不一。正常的多克隆淋巴细胞群的扩增片段含有不同长度的片段电泳检查时呈现出所谓的“片状”结构而单克隆的B淋巴细胞白血病标本经PCR扩增后产生一明显的同一长度的扩增片段电泳时呈现出紧密折带状结构。这就是应用PCR快速检测单克隆性的残留白 ...

应用锚定PCR技术对TCRδ链进行分析【操作方法】（1） 提取外周血淋巴细胞总RNA；（2） 利用oligo-dT或特异的C区序列作引物在逆转录酶作用下合成第一条cDNA链；（3） 于cDNA 3’末端添加Poly(dG)尾反应液(含2mmol/L CoCl21 mmol/L dGTP)和脱氧核酸末端转移酶(TdT)，37℃×1h;70℃终止反应，用乙醇沉淀DNA；（4） PCR扩增：基因5’端 ...

基于细胞物理性状的免疫细胞分离方法1、根据各种细胞比重的差异（1）自然沉降法（2）密度梯度离心法 ①Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cellPBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为1.075左右。利用 ...

外周血白细胞的分离1．自然沉降法　 人外周血红细胞与白细胞的比例约为6000～1000:1，两类细胞的沉降速度不同，据此加以分离。自然沉降法是利用红细胞自然沉降率较快加以分离。该法简便易行，对细胞损伤少，但纯度差。【试剂及配制】（1） 无Ca2+、Mg2+ Hank’s液（2） 含10%～20% 灭活小牛血清Hank’s液【操作方法】（1） 取静脉血2ml，放入加 ...

免疫细胞的分离 免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其它抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。 各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定籍以了解机体的免疫状态并 ...

白细胞的纯化1．低渗处理法【试剂及配制】（1）蒸馏水（2）1.8%氯化钠溶液【操作方法】（1） 上述各种方法所得白细胞悬液中加入1ml蒸馏水，轻轻地震荡20s，使混杂的红细胞裂解；（2） 加等量1.8%氯化钠溶液，调至等渗；（3） 再加Hank’s溶液混匀，离心沉淀，反复两次;（4） 取末次沉降细胞配成所需浓度的白细胞悬液。2.氯化铵处理法【试剂及配制】（1） ...

淋巴细胞的分离单核细胞和多核白细胞具有粘附在塑料或玻璃表面及吞噬羟基铁粉等特性，而淋巴细胞则不能，由此可将其从悬液中分离出来。（一）玻璃器皿吸附法【操作方法】（1） 将分离的外周血单个核细胞（PBMC）悬液（2×106 /ml）倾入 玻璃平皿中，于37℃温箱静置30～40min使单核细胞粘附与玻璃平皿上； ...

聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.077±0.0001。（2） 台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min 离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。（3） HBSS或RPM ...

聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液分离法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1） 1.5mol/L 10×PBS：称取10g NaCl，2.5g KCl，14.4g Na2HPO4，2.5g KH2PO4， 先用少量蒸馏水溶解上述各物，再用蒸馏水定溶至1000ml。 （1） 1×PBS：将上述10×PBS用蒸馏水稀释10倍即成。（2） ...

抗体/补体介导的特异性细胞毒作用分离法分离T细胞亚群人T淋巴细胞按其表面标志分为CD4+T和CD8+T细胞两类，其细胞膜上分别有CD4和CD8分子，当它们与相应的鼠抗人单克隆抗体结合后，在补体的参与下，可溶解相应的T细胞亚群，从而分离出另一种细胞亚群。【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）。（2） Hank’s液（内含5%小牛血清和1.0g/ ...

E花结形成分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞为了深入研究T、B细胞的生物学特性和功能，必需从淋巴细胞群体中分离出单一的T细胞或B细胞，以满足实验要求。根据T、B细胞膜表面标志及粘附能力等特性的不同，可将两者加以分离，常用的方法有E花结形成法、免疫吸附法和免疫磁性微珠分离法，近年来应用流式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或亚群。（一）此法是基于成熟的T细胞表面有独特的绵羊红细胞(SRBC)受体 ...

盘选(Panning)分离法分离T细胞亚群 聚苯乙烯表面可以用作亲和性试剂的不溶性基质以分离淋巴细胞亚群.聚苯乙烯培养皿首先用纯化的羊抗鼠IgG抗体包被然后将鼠抗人(如抗CD4或抗CD8单抗)与T细胞反应的细胞悬液加入培养皿中孵育一段时间后对CD4或CD8抗原特异的T细胞即结合到平皿表面而CD8+或CD4+细胞不结合轻吸出未贴壁的细胞悬液洗下粘附细胞。【试剂及配制】（1） 聚蔗糖- ...

流式细胞术分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞【试剂及配制】（1） RPMI-1640培养基：应选购不含酚红的，使用时加入5%的小牛血清。（2） FITC-抗CD3单克隆抗体：FITC为异硫氰酸荧光素，CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）。【操作方法】（1） 用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107 /ml；（2） ...

密度分离法分离单核细胞 单核细胞只占末梢血白细胞的3%～5%，比重与淋巴细胞近似，用离心的方法很难将二者分开。而利用上述贴壁法也很难将两者分开，且有损伤细胞及回收率低等缺点。现可用以下两种方法获得量较多且纯度较高的单核细胞。1．Colotta方法【试剂及配制】（1） pH 7.2 PBS液（2） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077）（3） ...

吸附分离法（贴壁法）分离单核细胞 单核细胞具有吸附于固相表面的特性，把单个核细胞放于玻璃或塑料平皿内，37℃于孵育一定时间后，吸附于平皿壁上的细胞即为单核细胞，未吸附的细胞即为淋巴细胞。【试剂及配制】（1）含5%小牛血清PRMI-1640培养基。（2）Hank’s液。【操作方法】（1） 含5%小牛血清PRMI-1640培养基将单个核细胞配成细胞悬液，将细胞悬液置于玻璃或 ...

人外周血中性粒细胞制备 利用右旋糖酐加速红细胞沉降，将富含白细胞的上层液用淋巴细胞分层液进行离心分离，使粒细胞沉于管底而与淋巴细胞和单核细胞分离。（一）小量分离法【试剂及配制】（1） 6%右旋糖酐生理盐水（2） 聚蔗糖-泛影葡胺分层（D=1.077）（3） 0.83% NH4Cl溶液：取0.83g NH4Cl、0.1g KHCO3 、0.0 ...

聚蔗糖-泛影葡胺法分离嗜碱性粒细胞【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层（D=1.085）（2） HEPES-ACM缓冲液：HEPES 25mmol/L中含CaCl2 1mmol、 NaCl 130mmol、 KCl 5mmol、 MgCl2 1mmol用1mol/L NaOH调节至pH7.4。（3） 无Ca2+、Mg2+Hank’s液【操作 ...

组织肥大细胞的分离肥大细胞不存在于循环血液中，需从有关组织如胃肠道和肺组织中获取，下面介绍从胃肠道组织中用机戒破碎，酶消化后获得肥大细胞的方法。【材料和试剂】（1） 肠片段3～5g（2） 含5% NCS的HBSS（3） 0.9%生理盐水（4） 含20% NCS和1ug/ml胶原酶的HBSS（5） 含20% NCS和 ...

树突状细胞（DC） 树突状细胞作为一种重要的抗原提呈细胞，参与免疫应答的启动和调节。它具有一些不同于其他细胞的特性如粘附性（过夜培养后，便失去粘附性）、比重较低等。人外周血中DC含量很少，仅占单个核细胞的0.1%～1%。利用细胞粘附和密度梯度离心的方法虽然可分离纯化外周血树突状细胞，但此法分离的DC，不仅纯度低，数量少，而且处于不同的分化阶段，已难以满足临床研究的需要。随着人们对DC发生学 ...

免疫荧光染色技术检测各类免疫细胞的数量 免疫细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中，其细胞膜表面均表达可供鉴别的特殊结构，即表面标志。其中CD分子常作为各类免疫细胞的表面标志用于免疫细胞的鉴定和分离以及用于检测在不同状态下某类免疫细胞数量的变化，能够反映机体免疫功能状态，有助于研究某种疾病的发病机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。【基本原理】 利用荧光素标记抗人T细胞亚群的单克 ...