酶学实验技术

问：现在想进行纤维素酶的纯化，不知道从哪里下手，请大家指教一下，非常感谢。 答：主要还是看你研究纤维素酶的目的是什么，是了解它的功能还是应用特点，还是研究它的发酵工艺，如果在发酵这块，没必要搞纯化，以提高酶活和优化工艺为主，也有很多东西可以做。 至于纯化，要先了解青霉产纤维素酶的现有报道，掌握酶系构成、提取、粗酶制备、检测方法等等，再考虑如何分离纯化不同组分。一般还是离子交换为主，先了解蛋白的分 ...

问：因我做的是非淀粉多糖酶制剂方面的课题，中间要测纤维素酶的活性，我用了两种方法测，但测的结果还是与标定的酶活性有很大的差距，不知道问题出在那里？？请高人指点哦！ 答：酶活性可分为全活性和比活性两种。酶的全活性为每克干物质每分钟释放的相应糖的微摩尔（µmol)数 单位为µmol/gDM min。酶的比活性为每毫克蛋白每分钟释放的相应糖的微摩尔（µmol)数，单 ...

问：本人要做纤维素酶的分离纯化，请高手传授方法。 答：纤维素酶并不是单一的蛋白酶，而是一个酶系，其中包括至少3种组分。如果你用重组菌表达其中的一个片段或者产酶基因，那么要看你的载体是什么？如果有亲和标签可以用亲和层析，如果没有，那就只能考虑疏水或离子交换等方法了。不过工业上制备纤维素酶一般是不用纯化的，中试以上规模的酶制剂生产大多采用真菌发酵，纤维素酶会直接分泌到培养基中，然后通过结晶就可以得到粗 ...

问：大看了个筛选纤维素酶的实验，要用CMC-NA ，可实验室没有，有可以代替的吗？ 答：当然有很多代替品了，比如说滤纸、稻草粉等。纤维素酶应该是一个比较复杂的酶系，如果单一的用CMC作为底物进行筛选，得到的酶不一定就是纤维素酶，建议使用稻草粉，这样能够比较真实地模拟自然环境，筛选得到的纤维素酶比较实用！ 答：我也做过这方面工作，有几个筛选配方可以给你，在附件里。 ...

问：我先后做了两批纤维素刚果红培养基筛选菌种，接种后，发现第一批能产生红色水解圈，而第二批能产透明圈．这两批培养基的配方完全相同，我想请教一下，到底应该产生什么效果？ 答：利用纤维素刚果红培养基筛选菌种的原理是： 1、刚果红可以跟大分子多糖牢固结合。 2、纤维素是大分子多糖，跟刚果红牢固结合。 3、纤维素酶降解平板中的纤维素成小分子糖，那么刚果红无法与小分子糖结合，就被洗脱下来，呈现透明圈。 4 ...

纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源，其生物降解完全是微生物--细菌和真菌完成的。 1、真菌：分泌胞外游离的纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素。 2、细菌纤维素酶则是以形成多酶复合体结构而起作用，能更加彻底有效地降解天然纤维素。 纤维素完全降解需要三类酶的协同作用：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖纤维二糖水解酶、B-葡萄糖苷酶。目前、纤维素酶的研究热点有： 1、以纤维素为添加剂 生产可完全降解的 ...

问：我要检测痰中弹性蛋白酶的活力，买的是sigma的底物，在410nm处比色，请问最后酶活力用什么单位来表示呢？加完底物后，立即比色，我隔5分钟就测定一次，一共测了一个小时。最后只得出了OD值，看相关书籍及各位战友以前的帖子，发现需要划出标准曲线，请各位高手指教，具体的测酶活力的具体步骤好吗？要做哪些标准曲线呢？谢谢！ 答：您每5min进行一次测定，我想目的应该是对酶反应时间进行考察，从而得出弹性 ...

问：用胰蛋白酶切蛋白需要加氯化钙吗？急！ 答：是要活化， 37度4小时， 或者30度 overnight with shaking。 问：我还想问一下，用什么作为活化液？我用的是三乙醇胺行吗？ 答：氯化钙是用来配制酶解缓冲液的，一般为5毫摩每升，也可以用已睛代替.或者就直接用40毫摩每升的碳酸氢胺。 我不知道你买的酶是哪个公司的，如果是SIGMA的，就不需要活化了，可以直接按照其说明书上的说明 ...

问：蛋白酶解肽段的纯化，去除杂质，去除，即可，不需要分离！请问怎么设计色谱条件呢？柱子，填料，流动相，流速？？谢谢！！ 问题比较菜！ 答：要看你的蛋白和酶解以后片断的大小了，楼主是要保留蛋白片断去除酶解buffer 里的东西么？一般根据样品中蛋白的大小和疏水性选择不同的柱子。常用的是反相疏水柱，几千的蛋白可以用C18硅胶键合柱，上万的要用C3的了。流动相主要是乙氰和水，流速要根据你的柱子大小而定 ...

问：吾欲纯化一种丝氨酸蛋白酶，为了保持其活性和防止其他酶的降解，吾欲加PMSF，行乎？ 答：你不能加PMSF，因为PMSF是一种不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制羧肽酶Y，糜蛋白酶，Factor Xa，木瓜蛋白酶，纤溶酶，蛋白酶K，枯草杆菌蛋白酶，凝血酶及胰蛋白酶。 不知道你的丝氨酸蛋白酶从哪里提取的，我们也在做丝氨酸蛋白酶的分离纯化，一般不加抑制剂，只是你操作的时候应该尽量保持低温，同时样品应 ...

问：我想用该法测一种蛋白酶对混合蛋白底物（其实是昆虫体壁蛋白）的酶活。请问：像我这种情况，还有必要做酪氨酸标准曲线吗，用得找吗？结果的酶活力应该怎么表示？是相当于对照吸光值增加的百分比吗？对照的设计，除传统的先加TCA后加底物外，我是否可以先用沸水浴灭活处理酶，然后按正常的顺序做底物，再做TCA？ 答：这个与Folin-酚有什么关系？ 1、你的底物不是酪蛋白。 2、沸水浴灭活处理酶，这样的对照肯定 ...

问：大家好，我要做牛胰蛋白酶的表达，但是还没有找到相关的文献，有谁知道他的序列，是223个氨基酸残基。现在这谢谢大家了！ 答：看看是不是这个！http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val=NM_001113727 LOCUS NM_001113727 879 bp mRNA linear MAM 22-JAN-2 ...

问：我用中性蛋白酶酶解我的样品后，跑了SDS-PAGE电泳，结果泳道上出现了蛋白酶的条带， 蛋白酶应该如何从样品中除去呢？是不是灭活后再离心就除去了？那为什么我离心后的样品中还有蛋白酶的存在呢？ 答：实在不行过个亲和色谱柱吧。 ...

问：我在蛋白方面比较菜，我有个蛋白需要做酶切，蛋白表达主要是以包涵体为主，溶解在8mol/l 尿素，或者1%SDS中，蛋白已经变性了，请问蛋白酶切是否能在变性的条件下酶切，还是一定要等到蛋白复性以后才能酶切? 还请指点一二。能否这样做，就是把变性的蛋白通过透析成酶切的缓冲液体系，然后再酶切，这样那些变性的尿素和SDS都去除，不知道这样操作符不符合理论？ 答：既然你的蛋白是包涵体，为什么不直接连接到 ...

问：请问各位高手，我想让酵母蛋白酶Ａ失活，决定采用ＰＣＲ进行ＤＮＡ序列的突变，此法行的通吗？可有前人研究过？ 答：国外有了"蛋白酶缺失"的用于重组蛋白表达的菌株。国内也许也有，小龙对于上游不大懂，不知道自己构建蛋白酶缺失的酵母菌是否有技术上的难度。参见一篇综述《生命的化学》2003 年23 卷1 期CHEMISTRY OF L IFE 2003，23(1) 酵母表达系统及其应 ...

问：蛋白酶底物Glt-ALA-ALA-phe-MCA，加入酶反映完毕后，需要用到excitation wavelength and emission wavelength， 高手能否解释一下，多谢。 答：你需要用两个波长，一个是激发波长，一个是释放波长，激发波长是用来激发酶反应，而释放波长，是反应后的生色产物的释放波长，可以通过测定吸光值得变化测定酶活 问：我用stop method 测活性 加 ...

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问：我购买的是GIBCO 0.25%(w/v)胰蛋白酶（25200-072）如何稀释成0.1%(w/v)？ 答：用D-Hanks液按一定的比例配置即可。 答：那要看你平时用什么缓冲液了。pbs，还是D－hanks？用你平时的那种缓冲液就行了。 ...

问：木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在消化组织块上有什么区别吗？哪一个效果更好？ 答：常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin），其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接，使组织或细胞片分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。 木瓜蛋白酶（Papain）是从木瓜果实中提炼而得的纯天然生物酶，简称木瓜酶；木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为27000u，由一种单肽链组成，含有2 ...

问：有人说白颜色胰蛋白酶的要比黄颜色的效果好，是吗？我近期买的胰蛋白酶倒是白颜色的，但是不能溶解在PBS中，呈细小的悬浮颗粒状，是GIBCO公司出产的。这会是什么原因呢？望各位师兄师姐回复。 答：以我们的经验确实是这样的，我们做过比较的是白颜色的比较好，究其原因我们认为是黄颜色的胰蛋白酶提纯不够，里面混有杂质所致。 ...