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        纤维素酶酶活的测定方法

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        问:因我做的是非淀粉多糖酶制剂方面的课题,中间要测纤维素酶的活性,我用了两种方法测,但测的结果还是与标定的酶活性有很大的差距,不知道问题出在那里?请高人指点!

        答:酶活性可分为全活性和比活性两种。酶的全活性为每克干物质每分钟释放的相应糖的微摩尔(µmol)数 , 单位为µmol/gDM min。酶的比活性为每毫克蛋白每分钟释放的相应糖的微摩尔(µmol)数,单位为µmol/gProtein min。以下是我用过的方法:

        全活性:取4支15ml试管,每支试管中加入1.5 mL.39℃预热的2%羧甲基纤维素钠(内含0.1 mg/mL硫柳汞),其中1号试管为试剂空白,加入0.01 M,pH6.8磷酸钠缓冲液1 ml; 2号试管为酶样空白,什么也不加;3,4号试管为酶样平行样,各加入1 ml酶液,4支试管同时放入39℃水浴回旋震荡培养60 min。培养后4支试管立即加入3 mL DNS (3,5-一硝基水杨酸溶液),再在2号试管中加入1 ml预先制备好的酶液,用旋涡震荡仪混匀后在开水浴中煮沸5 min,取出后用水冷却5min。以1号试管为空白,在紫外分光光度计上560 nm处进行比色。

        以D-葡萄糖作为标样,葡萄糖标准曲线的绘制:称取无水葡萄糖1.00g,溶于100 mL容量瓶中,制成浓度为10 mg/mL葡萄糖溶液,再从中依次吸收1,2,3,4,5,6 ml各溶于100 mL容量瓶中,制成浓度为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL溶液,吸取1.0 mL葡萄糖溶液加入3 mL DNS,煮沸5 min,冷却5 min于560 nm处比色,绘制标准曲线。

        比活性:用考马斯亮蓝法确定酶液的蛋白浓度,使用牛血清白蛋白做标样。其他的与全活性相同。

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