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p猫：稳定转染之后的细胞为什么荧光强度会有很大的不同？ 在建立稳定株的整个过程中都存在这个问题，理论上说同一个细胞克隆出来的细胞团里面的每个细胞表达蛋白的水平应该是一样的吧，可是为什么荧光显微镜下看荧光强度差异却很大呢？这样的稳定株能用来做后续的实验吗？ 丁香园网友lhczj认为： 如果不考虑荧光强度，细胞能够长时间保持有荧光，可以继续实验 我周围很多做稳定转染的也有这种情况 丁香园网友dtlxj ...

zy_dalian：请问Lipofectamine2000使用高手：转染后多久加药物? 加LIPO2000后，我选择4小时后换培养基. 那大家是换液后多久加药进行研究的呢?（根据自己研究的不同，药物是不同的）； 先谢谢啦！ 丁香园网友silentjill认为： 说明书上不是说的48-72小时后就可以了么？ 丁香园网友出来混的认为： 我是根据转的效率加药的 丁香园网友applezph认为： 一般Li ...

guoguoloo：彗星试验电泳前的细胞应该用什么方法保存 最近要做大鼠脑组织细胞和血淋巴细胞的彗星试验。因为取完组织细胞后不能立刻跑电泳，请问脑组织该如何保存，4度，-20度，-80度或液氮？ 丁香园网友hjhj4604认为： 比较麻烦，冷冻或低温都会对细胞造成DNA损伤，影响结果。 建议现取现做，实在不行暂放４度，时间不可过长。 丁香园网友djhmily认为： 请问，我把细胞收集了（PBS离心 ...

xiangyu_16888：关于稳定转染的若干问题 1 转染后24小时以1：10的稀释比例加入新鲜的含G418的培养基中，其目的是什么? 2 此时换液是否将DNA-脂肢体复合物去处? 3 加入G418的量是按体积加还是按细胞数加? 4 转染后培养基除了G418是否也加入双抗? 谢谢各位大虾了！ 丁香园网友bigbang_0_0认为： 1.利于两周后挑取单克隆. 2.是. 3.按体积加. 4.是. ...

shilei5794749：透明菌落OR 乳白色菌落？ 重组质粒做完转化后，板上长出来的菌落有透明的，有乳白色的．听说重组质粒长出来的菌应该是乳白色的，而透明的菌落很有可能是杂菌？？请问各位战友，这种说法有根据吗？？ 丁香园网友applepie118认为： 这种说法，至少在我作转化来看没有什么根据。 为什么会是乳白色得，难道是插入得片断引起了表型得变化，但是并不是每个插入片断都正好插入到质粒中影响 ...

Emmanuelle：用于转染的培养基有何要求? 为什么用于转染的培养基不能含有血清? 丁香园网友rissa999认为： 这个能不能含血清是要看你用什么转染载体的，其实有些阳离子脂质体和高分子聚合物类的转染载体可在有血清的培养基中进行转染。 一般情况下，用无血清的培养基主要是因为转染载体带正电荷，而血清中含有大量负电性的成分会竞争结合正电性的载体，导致载体与DNA复合物的稳定性降低，从而使转染效率 ...

1、在病原生物学领域中的应用 甲醇酵母表达系统经过20多年的发展，已成为较完善的外源基因表达系统。应用该系统已高效分泌表达了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白、蛋白酶抑制剂、膜蛋白等。。。在国内，甲醇营养型酵母表达系统主要应用在病 原生物学领域，如：SMAD4 (肿瘤抑制基因)蛋白、痘苗病毒生长因子(VGF)戊型肝炎病毒结 构区ORF2蛋 ...

1、问：我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白，小量表达并做SDS－PAGE有一条类似三聚体的条带。用大量表达，表达上清用镍柱进行亲和层析，在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，为什么呢？请赐教 参考见解：你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1确定你的蛋白确实有表达;2亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事 ...

酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量 ...

试验的注意事项 1、信号肽识别位点的设计 以质粒pPICZαA为例。在利用PCR反应在外源基因两端引入酶切位点的试验中。如果质粒pPICZαA双酶切中丢失了KEX2蛋白酶的酶切位点Lys－Arg，应该在上游中，增加了编码Lys、Arg的密码子AAA、AGA 。酵母细胞膜中中的KEX2蛋白酶是α-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点Lys－Arg，通过 ...

P.Pastoris表达载体及其元件 由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或 Zeocin) ...

存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物 ...

分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 1、CHO细胞表达体系及其特点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的 ...

分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就 CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 CHO细胞表达体系及其特点 诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成 ...

【求助】有没有战友用24孔板做过成骨细胞的钙结节染色计数？ 参与者：qianjunqz 有没有战友用24孔板做过成骨细胞的钙结节染色计数？如果有，请问在这一过程中要注意些什么问题？谢谢！！ 参与者：houjiaquan 染色后还要计数吗？怎么操作？关注中 参与者：qianjunqz 我也没做过，在文献上看到，很多都做钙化结节染色计数 参与者：sunlijun0918 是用四环素染色吗，我做过统计钙 ...

【求助】ELISA测细胞上清肿瘤坏死因子TNF-a 参与者：juaden 我做体外细胞实验看某种药物刺激下小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-a的量 买的是BIO-source的ELISA试剂盒 标准曲线很正常 但是挑选LPS作为阳性对照 阳性结果很不明显 几乎就是空白值 请教做过的老师同学 LPS浓度和刺激时间有什么特别的要求么？ 还有 细胞上清测之前需要特殊处理么？如蛋白酶灭活之类的 谢谢！ 参与者： ...

【求助】关于TGF-Beta，FN酶联免疫（ELISA）试剂盒的选择 参与者：txl4fox 我是要酶联免疫（ELISA）的方法测细胞上清液中的TGF-Beta，FN抗原的表达情况，关于ELISA试剂盒的选择我想请教几个问题：我想买酶标板自己包被一抗，那我应该如何选择ELISA试剂盒？有没有不带酶标板只带一抗，二抗，酶底物，以及底物显色剂而且够做五六张板的ELISA试剂盒？如果没有，是不是我应该分 ...

【求助】急：免疫细胞化学PBSA和PBST的配制 参与者：greentrees 搜索了一下，没有找到详细的配制方案 不知道这两个怎么配制阿？ PBSA=PBS+BSA，BSA是买的sigma分装的，浓度1% PBST中的T是Triton嘛？我看到很多是指Tween，也有说是Triton的，到底是哪个阿？T的浓度多少阿？ 爬片的洗液是不是TBS比PBS更好呢？ 我要检测的目标抗原在胞浆内。 参与者： ...

【求助】请问细胞凋亡后beta－actin会降解吗？ 参与者：xywu2003 我的蛋白可能有凋亡作用，用anti－beta actin抗体做wb，未转染细胞（正常细胞）有条带，转染空质粒和带目的基因的质粒无条带，请问这是为什么？ 参与者：jfeiharry beta actin is a type of cell skeleton protein.Its gene is a house keep ...

【求助】茜素红染液配制？ 参与者：qianjunqz 前面有位兄弟已经发过类似的帖子，但答案都不太完整，这里我想重新把这个问题提出来，希望大家帮助解决。 1）Tris－HCl是缓冲液，是先配PH值8.3的Tris－HCl，再加入茜素红，还是加入茜素红后再调节溶液PH至8.3？ 2）茜素红的规格是怎么样的，要加多少量的茜素红哪？ 参与者：liuzeyi2002 茜素红S 中文名称： 茜素红S英文名称 ...