细胞成分提取

细胞/组织裂解液：1. 溶液准备：2×样品缓冲液：130mM Tris-HCl （ pH8.0 ） 20% （ v/v ） 甘油 4.6% （ w/v ） SDS 0.02% 溴酚蓝；2%DTT；PBS （ pH7.4 ） :10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4 ，50mM NaCl，2.7mM KCl；RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl ...

裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。这两种方法（包括SDS 和溶菌酶处理等）提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。 一、机械裂解法主要有以下两中： 1、热休克（Thermal shock），既 ...

问：我要分离细胞器，先要破碎细胞。查文章是用Polytron匀浆器或Dounce匀浆器或者Potter-Elvehjem匀浆器。请问它们有什么区别吗？价格是多少呢？细胞破碎能用玻璃的普通匀浆器代替吗？ 答：不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。具体如下： 一、细胞器的分离：制备某种生物大分子时，往往需要采用细胞中某一部分为材料；或者为了纯化某一特定细胞器上的生物 ...

1ml RIPA buffer contains 35μL proteinase inhibitor(sigma cat no P8340) and 10μl phosphatase inhibitor RIPA buffer 最终浓度 1M Tris-HCl pH7.5) 5 ml 50mM NaCl 0.87g 0.15 M Na-deoxycholale 0.1g （1%） 0. ...

Apoptosis-DNA ladder Assay 1. Collect c μlture media add 1 ml of trypsin to cell mono1ayer on 100-mmol/L dishes scrape the cells harvest cells (c μlture media and cell monolayer) by centrifugat ...

问：刚买了南京建成的LDH试剂盒，打算用酶标仪检测细胞的LDH释放率，但是有几个问题比较困惑？ 1、用96孔板种细胞，密度应该种多大？ 2、细胞培养液应该加多少？用1640会影响OD值的测定吗？是否应加上单独培养液作为对照呢？ 3、测上清液的LDH时，应该取多少作为样本呢？ 4、超声破碎细胞时，需要破碎多长时间？ 5、因用96孔板检测，可否将说明书中的液体用量减到1/10？这样会对结果有影响吗？ ...

问：我提取的是贴壁细胞蛋白，过程是1、PBS洗2遍后，细胞刮刮下后离心（没有消化，这样可以吗？）2、去上清，每管加入了加了188微升的裂解液和12微升的PMSF（是不是太多了？）。3、离心后，吸取140微升上清到新EP管中。4、加入5×sds上样缓冲和DTT（请问，这一步的我的比例应该是多少？我是上清：SDS:DTT=7：2：1。）今天跑胶后，考马斯亮蓝染色发现，条带淡到要靠想像才能看 ...

问：最近准备分析RNA的表达水平，园子里有人是从组织里面提取，有人从血液提取，想问的是，对于同一个人，这两种提取方法有什么区别吗，两种方法RNA的提取量有区别吗？ 答：血液里面提RNA比较麻烦，量也少，前期处理如下： 1、无菌采集静脉血2 ml注入盛有2 ml Hank’s液（含100 u/ml肝素）的试管中，混匀。 2、吸取淋巴细胞分层液2 ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管 ...

DXY网友qingraner提问：本人核浆分离做了最少两个月了吧，似乎没有什么进展，我想请问高人指点一下。我很想知道我的配方有什么问题，或者是我的操作有什么需要注意的地方。十分感谢！还有，我检测的方法是用Ikb-α（标细胞质）和Oct-1（标细胞核），似乎抗体也不是很好用。我做的是BT474细胞，breast cancer cell。 我的方法如下： 1、用Buffer A 洗涤 2、 ...

问：我现在在养细胞，然后收细胞抽蛋白以及提RNA用，我想先多收点细胞冻着。想问一下怎样收集细胞，有具体的流程吗？ 我是这样做的： 1、将细胞消化吹打后转移至离心管离心 2、倒去上清，加1 mlPBS打匀后转移至1.5 ml EP管 3、离心12000 rpm 2 min （不知道大家这里用多少转速，有讲究吗？） 4、倒去上清，我是将EP管倒置一会，但是EP管里面还是有一些上清，我没有倒干净，请问是 ...

DXY网友mao_xianwang提问：最近测酶活性，但觉问题一大堆！ 1、接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？ 2、给细胞染毒时我听说有两种方案，比如说染三天毒 （1）先接种20%-30%，三天之后收获时刚好长满 （2）一开始就接种70%-80%，然后以3%或者5%血清，这样尽量不让细胞分裂增值，三天之后收获试问，哪个更可行呢？ 3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子 ...

DXY网友mavisw提问：我用六孔板做细胞转染，转后要做western blot检测，今天裂解转染后的细胞时直接往六孔板的每个孔中加入了400微升的细胞裂解液，收集离心后未见沉淀，不知道用裂解产物做western blot蛋白含量够不够？DXY网友Pureflat回复：六孔板中加入400微升裂解液太多，这样会使你得到的蛋白浓度过低，满足不了Western blot上样的需要，我第一次做这个实验时 ...

DXY网友sunyuxiaoxi提问：细胞状态很好，想尽快做western blot。但是存在以下问题：我要在培养的细胞中注射一种药物，观察此药物作用不同时间下我要检测的指标的变化。我取的时间点是：注射药物后10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h。能否待我把各时间点的细胞都收集好了，再统一加细胞裂解液，然后测蛋白？ 但我所在实验室的有些同学说：不可以，必须是收集完细胞后马上加裂 ...

DXY网友molihua505提问：这两天做的western，细胞用过氧化氢处理后再提的蛋白。过氧化氢引起细胞损伤，有一些死细胞，我又把培养基中的死细胞离心取沉淀了。 发现浓度较大的组，目的蛋白减少和对照组相比变化不怎么明显，而相对应的actin（肌动蛋白）却比对照少了许多，想问过氧化氢能使actin减少吗，导致过氧化氢处理后内参不应该再用actin了？这是怎么回事啊？ DXY网友yangea回复 ...

问：用800g - 8600g 分离线粒体后，得到浅褐色-褐色物质，哪一种组分才是真正的线粒体啊？ 答：褐色物质就是线粒体，用JANUS GREEN B染色就可验证。 ...

DXY网友yfq1232000提问： 今天做了一个小抽，但跑电泳时却没有条带，我抽过多次质粒，应该不会抽不出来，我考虑是不是菌液里没有我要的菌，是杂菌，但是我的LB里放了amp+，如果有杂菌的话那么也抗amp+，而一般的抗性基因都位于质粒上，而试剂盒又不仅仅是只能抽DH-5a的质粒，那么也是应该可以抽出杂菌的质粒，这样的话也是应该有条带的啊？这是为什么? DXY网友heartips回复： 1、小 ...

1、第一种方法 试剂： 变性液组成：25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB中（42 mmol/L pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mmol/L β-巯基乙醇），65 ℃溶解，过滤灭菌，4 ℃预冷。 酸性酚配制：55 ℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mmol/L，pH4. ...

问：我打算检测线粒体膜电位，大鼠肺移植后，如何分离肺泡上皮细胞呢？ 答：步骤如下： 1、取得完全无血液残留的肺脏： 实验前将大鼠全身血液放净，取得完全无血液残留的肺脏。 2、消化肺组织： 常用于细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮细胞的酶，现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定，有效作用时间短暂，容易自我降解等问题。Dobbs ...

1、做液闪仪测心肌细胞线粒体ANT转运酶活性检测，请问有没有非超声破膜的方法（没超声破碎仪）？ 2、若提得线粒体，如何看它有没有活性呢，用詹那绿B 就可以么？ 3、液闪仪大概需要多少样本量？ 丁香园网友dhh认为： 提取新鲜心肌组织细胞内线粒体的方案： 1、心肌组织切碎后在4℃介质（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH7.4，0-4℃）中制备心肌组织匀浆。匀浆经75 ...

问：我要用上清液做Elisa，但是上清液中的蛋白浓度不够，请问有什么方法可以把蛋白浓缩一下? 答：蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 1、透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂 ...