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        加多了细胞裂解液是否有补救措施

        互联网

        14010

        问:我提取的是贴壁细胞蛋白,过程是

        1、PBS洗2遍后,细胞刮刮下后离心(没有消化,这样可以吗?)

        2、去上清,每管加入了加了188微升的裂解液和12微升的PMSF(是不是太多了?)

        3、离心后,吸取140微升上清到新EP管中。

        4、加入5×sds上样缓冲和DTT(这一步的我的比例应该是多少?上清:SDS:DTT=7:2:1)

        今天跑胶后,考马斯亮蓝染色发现,条带淡到要靠想像才能看到。请问这样裂解液是不是加多了导致蛋白浓度稀释?我还有一批没有上样变性的蛋白,还有什么补救措施没有,细胞蛋白SDS上样比例是多少?

        答:我觉得你做western不够规范

        1、贴壁细胞刮下来或消化下来都可以

        2、PMSF一般配成100 mmol/L的储备液(乙醇或异丙醇溶解),然后按1:100稀释到裂解液里,终浓度是1 mmol/L。

        3、跑蛋白时,除非你是做表达或看条带有无的,一般都要定量啊,用bcakit或者考马斯定量(后者不是很准,但便宜),至于多少细胞加多少裂解液,一般要靠经验,我主要是看细胞离下来体积的大小决定加多少裂解液的。上样缓冲液有配方的,网上都可以查到。

        4、考马斯亮蓝染蛋白是有灵敏度限制的,好像是10 μg吧,在网上能查到,对了,还要排除考染的步骤和配方,园子里有很多不错的帖子可以借鉴。

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