western-blot

最近的一个月时间里，开始我的实验，因为在本科的时候生物技术试验的时候都是按照试验书上一步步的做，等于没有接触过真正的实验，所以做western几乎是从头学起的。以下是我自己这一个月的收获，希望对大家有所启示：1.蛋白样本的制备：因为我提取的是大鼠的海马组织，自己觉得脑组织因为比较软，所以用塑料研磨棒（而且高压后还能重复利用）就OK，不用匀浆振荡器就行。而相比较心肌组织比较硬，可以考虑用那个。如果说有的同学觉得上样 ...

Heparin-Sepharose Precipitation and ImmunoblottingTo analyze for CTGF protein expression, conditioned media were collected and the heparin-binding proteins were precipitated by end-over-end mixing for 4 h at 4°C with heparin-Sepharose CL-6B beads from Pharmacia (Piscata ...

商品名称规格数量单价0.5ml离心管1000支/包1180.001.5 ml离心管500支/包1100.002.0 ml离心管500支/包1110.00非变性裂解液100ml1160.00ECL超敏发光液 25ml1160.00WB膜封闭液50ml140.00考马斯亮蓝G-25010g1130.00甘氨酸500g178.00丽春红s10g180.00预染低范围蛋白质分子量标准（30-80KD）20次1320.00Bradford ...

Western Blot 内参选择要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗 ...

【转】五年western blot 实验经验总结1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元 ...

Western Blot一．配胶1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶 ...

专注于一站式科研实验服务外包的亿鸣复兴生物科技 ---承接科研课题实验设计，代做实验，数据分析 1. 建DGGE变性梯度凝胶电泳 细菌和真菌多样性分析 2. Western Blot项目 3. SNP项目 4. STR项目 5. Footprinting项目 6. 分子克隆 7. 菌种鉴定 8. 细/真菌等微生物多样性分析 9.QPCR项目 10. 重组慢病毒/腺病毒载体包装 11. 稳定细胞株筛选 12. 全基因合成 等分子生物学方面的实验把珍贵的创意留给自己，把繁琐的实验交给亿鸣复兴！ 周德清 北京亿鸣复兴生物科技有限公司 手机： 1 ...

暗室实验暗室实验的操作流程：1. 新鲜配制1-2ml工作液（A液与B液1:1或1:40混合配制）2. 进入暗室，在黑暗的条件下，加入1μl未稀释的二抗（HRP连接物）3. 混合后，可立即在暗室中观察到蓝色光暗室实验的注意事项：? 工作液按正确比例混合，且新鲜配制? 在暗室中加入二抗? 直接使用未稀释的二抗? 加入二抗后，立即观察注：暗室实验可同时检测底物是否有活性，以及二抗是否有活性。如果暗室实验结果阴性：更换其它二抗，再次进行检测；再次检测结果仍为 ...

一、蛋白样品的制备与定量（提取好的蛋白是成功的一半）（1）提细胞蛋白① 消化或刮下细胞至1.5的EP管中，标记，10000r离心2min，PBS洗2-3遍。② 尽量吸去EP管中PBS，加适量RIPA裂解液（RIPA裂解液+蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联装）。③ 冰上裂解30min~1h，开4°离心机。④ 4°离心11000r，20min。⑤ 取上清，测蛋白浓度，加蛋白上清的四分之一体积5x上样loading buffer，煮沸（95℃加热5min），分装。（2） ...

一、关于CCD相机的另一些指标：拍摄凝胶的专业CCD相机要用单色的。不能用彩色的。CCD相机的象素基本上都在一百万多一点。拍摄的照片像素就是1000 X 1000多一点。好的CCD相机能拍摄12位深度甚至16位深度的灰度图片。这是拍摄弱光样品所必需的。冷CCD拍摄弱光样品时感光度更高。像化学发光膜这种弱光，最好用低于环境温度20度的冷CCD拍摄。拍摄凝胶照片有什么技巧？有。第一个注意事项是要把样品图片拍摄得尽可能大。让 ...

无论是DNA电泳图片还是RNA电泳图片，或者是蛋白的凝胶电泳图片包括Western blot膜、或者是化学发光膜图片，在图像分析的角度来看，都是同样的一种条带光密度分析的问题。分析电泳条带有专门的一类图像分析软件。常见的是Bandscan, Quantity One, 由各个凝胶电泳成像系统厂商自己编制的软件就更多了。我喜欢用的是Labworks, 是UVP公司生产的凝胶电泳成像系统上配用的拍摄与分析软件，实际上就是传说中大名 ...

一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细 ...

高斯建模与结果分析：a.高斯建模，即用数学方法（微积分）对正态分布曲线进行统计分析。理论上每道band的光密度都呈正态分布的平滑曲线（每个band中间位置蛋白压缩最紧浓度最高，向上向下因扩散而减弱）；然而实际操作过程中，如果荧光过强，往往出现类似方波的曲线（曲线无peak峰，上方为平滑直线，超识别的最高阈值）；荧光较弱宜出现波浪样（多）波峰，或难与背景区分。首先电脑会统计band中每个点的光密度值，并对这些值按正态分布 ...

创建条带：在上一期，我们已经识别和分析了电泳图片的泳道，下面我们开始研究电泳条带的问题。首先在这里明确两个名词翻译：“Lane”指电泳泳道；“Band”指电泳条带（在下文中一律使用这两个英文名词来表示这两个意思）。a.电泳条带的识别：和前面研究Lane一样，首先我们要对Lane上的Band进行识别。识别方式同样分为自动识别和人工识别。自动识别的时候选择“Band-Detect Bands...”命令。这时Quantity One ...

10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.（3）现用现配，配好后4度避光保存。11、如何才能充分脱蜡？（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、 ...

如何正确使用Quantiy One定量：（以下文字系摘录+改写整合）WB做完，有时候我们需要对结果进行定量。目前最备受推崇的应该非Biorad公司的Quantiy One软件莫属，然而其$6K左右的售价令很多人望而却步；不过，这款软件之所以敢如此漫天要价，其最大的优点莫过于自动识别条带代替人工分析以降低主观误差，同时它的很多功能渗透了艰深的数理理论以及概率统计的原理，这在其它各类免费的随机附送的蛋白定量软件上是乏善可 ...

Stirpping：完整的WB流程结束后，可能需要重新标记某些膜，这时候就“可能”需要对膜stripping。这里用了“可能”二字，即不一定必须，那么首先讨论一下stripping的必要性。Stripping排除其他的不讲，整个流程会耗费不少的时间，从节约时间的角度来讲能不做最好；并且stripping条件过于激烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜表面的抗原使WB的最终信号削弱；此外，stripping buffer未 ...

Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，不同的是其采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽的类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，并经过底物显色检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

显影--淬灭的祸因当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：交联在二抗上的HRP酶能 ...

那么如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？--这下配方无限多了吧。1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% ...