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        WB实战指南(六):孵育条件优化

        丁香园

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        那么如何通过改变抗体稀释液的配方,寻求抗体孵育的最佳条件呢?

        首先要认清,抗体稀释液没有一个绝对通用的配方;一种抗体一个脾气。

        其次,抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度,以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。

        目前,抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk,BSA和gelatin,似乎很少的样子 。。。可是,你有没有考虑过“复方”?--这下配方无限多了吧。

        1. 采用milk,BSA和gelatin的单方。3% milk,5% BSA,<=0.4%的gelatin,并根据实际情况改变(若出现白板,请降低封闭剂浓度。;黑板多加)。gelatin大家可能比较陌生,不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方,你会发现很多抗体溶液里都有它。

        2.很多情况下单方的浓度很高了,背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的,比如gelatin+BSA时,gelatin浓度不能无限提高(会完全竞争掉抗原抗体特异性结合,导致白板),BSA的浓度较随意。

        3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST,也可用高盐浓度的缓冲液(NaCl 0.5M)以降低背景;但是切记,有的抗体对盐浓度敏感,包括构象和溶解度,因此需要尝试。

        如果以上策略仍然无法解决高背景,可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料(新的)放在一起孵育个把小时再用。如果还不行,彻底无解,结论抗体太差;请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。

        这三种封闭蛋白的差异:

        milk和gelatin封闭效果不错且价格便宜,但milk容易发霉变质,且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合(拮抗与抗原结合尤其突出;更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL!?);BSA封闭效果不佳,且价格较昂贵。

        个人推荐gelatin,gelatin主要成分是骨胶原,蛋白很大,但可以通过加热打断成小蛋白,从而实现封闭各种分子量大小的蛋白。通常,我会将gelatin加到TBST中后直接灭菌,灭菌过程中,不溶的gelatin会逐渐溶解;由于gelatin可以灭菌(milk不可以),所以同样条件下,gelatin的存放时间明显长于milk。

        实际上,抗体可以反复用很久(通常一般的抗体常规稀释比,可以连续用一个月以上;

        对于老手用过2、3次的旧抗体更prefer,因此背景降到很低而效价正是最高的时候),通常抗体最后失效的原因不是因为使用次数过多,而是染菌;比较旧的抗体都会有很多的沉淀在底部,更长时间还会有异味。

        稀释的一抗靠添加NaN3并于4度保存延长使用时间;二抗不能加NaN3,但放在-20度反复冻融延长使用寿命(抗体并非绝对不可以冻融;只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响)。

        抗体稀释液(一抗、二抗稀释液也可同也可不同)和封闭液可以相同,可以不同,因为抗体稀释液可以采用复方的,所以即使混合了少许,不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时,gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。

        由于以上诸多可变因素,实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液(只能是多数通用),因此对待具体问题时,请具体对待(多花点心思摸索吧)。

        感谢丁香园论坛铁杆站友 jacqueslm2001

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