western-blot

1.完成western blot实验步骤：一、蛋白样品的提取：1.弃去旧培养基，用PBS清洗2次2.加入胰酶消化，待细胞消化完成后，加入少量培养基终止消化反应3.吸取细胞至离心管中，尽可能完全收集，离心，2500rpm，5min4.弃上清，加1ml PBS清洗，将其移入EP管中，再次离心，2500rpm（13000rpm也可），5min，将残液吸取完全（-80℃冰箱内放置过夜，也可长期保存）5.向每个EP管中加入适量IP裂解液（蛋白酶 ...

Running Protein GelsSolutions10X Running Buffer (0.25 M Tris, 1.92 M glycine, 1% SDS)121 g Tris577 g glycine40 g SDSddh20 to 4 L (check pH at 1:10 dilution (pH=~8.8)).5X Sample Buffer (0.3125 M Tris pH 6.8, 10% SDS, 50% glycerol, 0.005% bromophenol blue, 25% 2-mercaptoethanol)1.56 ml 2M Tris pH 6.81 g SDS5 ml glycero ...

国内做western的实验室现在很多，但是western因为是历时比较长，试剂多，总是出现各种各样的问题，园子里帖子很多，讲述经验的，在这发帖主要是想让大家抒发一些做western的感受以及感觉实验的key point是什么，最容易犯的错误是什么，希望大家踊跃发音，其中附一篇网上及园子里流传很广的一篇文章，希望大家多多跟帖，发表自己的感想这是园子里的一篇帖子，非常欣赏，转过来，希望大家多写写，主要是1 key point 2最 ...

Western的原理几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关 ...

Western Blot为什么必须要用内参?要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的 ...

以前做的很好看的条带现在怎么做也做不出来原来的效果了，所有的液体和buffer都换了，尝试了很多次，都没见改善，大家来帮忙看看问题出在哪里？1，做的好的内参：不管齐不齐，但至少条带是一根一根的，边界很清楚，没有糊，没有影子，干净，即使中间空一个泳道，也不会出现串孔的现象。2，做的好的目的蛋白：可能拍照的原因出现了很多格子，但是不影响，目的条带是两条带，同样每跟都很清晰，没有串孔，没有拖带，边缘没有发毛发糊。以上两条是同一 ...

一、Western Blot成功要素 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 ...

Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buf ...

来论坛好长时间了，陆陆续续回复了一些帖子，可是回来回去，发现大家提的问题，还是那几个，看过很多总结经验的帖子，要么抄书本，要么人云亦云，缺乏自己的东西，新手参考这些当然难获进益。本人把自己多年的Western blotting实践经验整理一下，欢迎行家批评指正。首先，摆摆自己的经验。鄙人做WB有8、9年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上24+，一作单篇15+（系国内完成）其次，由于一些机缘的因素，在实验 ...

Lysis buffer(western)Stock solutions Working Solution working --50ml1M Tris 20mM 1ml5M Nacl 100mM 1ml0.1M EDTA 2mM 1ml1%NP-40 0.5mlWorking solution 5ml 10ml1mM PMSF 50ul(100mM) 100ul25mMNaF 50ul(2.5M) 100ul10uM ALLN 5ul(10mM) 10ul10uM ALLM 5ul(10mM) 10ul0.1mM Sodium Ortho ...

1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多 ...

蛋白样品制备一、实验试剂与器材1×PBS，细胞裂解液，组织块，上样缓冲液，细胞刮，移液器，EP管，均浆器，离心机，加热器二、实验步骤事先准备好碎冰，干净的均浆器插在冰上。准备好各种枪头、移液器、EP管、切组织用的消过毒的手术刀、干净的玻璃板和事先准备好的裂解液（根据需要加入合适浓度的蛋白酶抑制剂）↓迅速取出低温冻存的组织块，各样品切取合适大小使称重尽量一致↓将组织低温中研碎，然后倒入EP管，加入裂解液冰上裂解。↓组织被充分 ...

1.根据厂家说明安装玻璃板，用1%热琼脂糖（用1X的电泳液配制，普通琼脂）封闭玻璃板三边间隙，以防灌胶时漏胶。2.在三角瓶中配制8%的分离胶20ml，因为目的蛋白分子量较大，因此用8%的分离胶进行电泳检测；GAPDH 用10%分离胶检测。依次加入各成分，每加一种试剂均要混匀。加入TEMED后，立即快速旋动混合物, 并进行下步的操作。分 离 胶成 分 体积（20ml） 8% 10%水 9.3 8.0430%丙烯酰胺 5.3 6.661.5Mtris(Ph8.8) 5.0 5.010%过硫酸胺 0 ...

问题 可能原因验证或解决办法1 转膜不充分 膜没有完全均匀湿透； 使用100% methanol浸透膜 靶蛋白分子量小于10,000； 选择小孔径的膜，缩短转移时间 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值； 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 甲醇浓度过高； 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 转移时间 ...

做了两个月的时间的 western blotting 终于出了比较好的结果。老板让整理出protocol这是写的PROTOCOL大概会有很多错误请大家指正！谢谢先WESTERN PROTOCOLA.Preparation of Samples1.Get the heads of the fly2.Stir them in the lysis buffer(4heads/10ul)3.Add 2XSDS-gel-loading buffer(4heads/10ul)4.Spin at 112 ...

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1 ...

Western Blot相关的试剂和耗材产　品　名　称包　装单　价(RMB)Trypsin-EDTA0.25%,100ml150.00蛋白裂解液（蛋白提取液）10ml60.00PMSF100mM 10ml86.0040% Acr/Bis (37.5:1)100ml100.0040% Acr/Bis (29:1)100ml100.0040% Acr/Bis (19:1)100ml100.00SDS-PAGE蛋白上样缓冲液2x,1ml28.00SDS-PAGE电泳缓冲液10x,500 ...

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1 ...

新的不能再新的菜鸟，没有师兄师姐带，也没有实验室老师带，完全自己摸索，到各个同学那里蹭经验。马上要做western，故将总结的western经验步骤po上来，一为求各位坛子里的大神垂怜，可以给予指导解惑，二来，也可与各位即将做western的新人一起交流心得，分享失败教训经验。若有不当之处，还请各位前辈、同仁给予指出，叩谢。明日开始从提蛋白开始，今先po一部分步骤，明天晚上来汇报结果。一、细胞总蛋白提取：1、PIPA（ ...

Western Blot详解－主要试剂主要试剂1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、 十二烷基 ...