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        【专题讨论】多种WB条带问题,时好时坏,找不到原因,大家帮忙来!

        丁香园论坛

        18026

        以前做的很好看的条带现在怎么做也做不出来原来的效果了,所有的液体和buffer都换了,尝试了很多次,都没见改善,大家来帮忙看看问题出在哪里?

        1,做的好的内参:不管齐不齐,但至少条带是一根一根的,边界很清楚,没有糊,没有影子,干净,即使中间空一个泳道,也不会出现串孔的现象。

        【专题讨论】多种WB条带问题,时好时坏,找不到原因,大家帮忙来!

        2,做的好的目的蛋白:可能拍照的原因出现了很多格子,但是不影响,目的条带是两条带,同样每跟都很清晰,没有串孔,没有拖带,边缘没有发毛发糊。

        【专题讨论】多种WB条带问题,时好时坏,找不到原因,大家帮忙来!

        以上两条是同一时期做出来的,那时基本怎么做怎么出来,都很漂亮。

        可是下面的就有很多问题了,条带基本看不清楚,不能用。

        3,问题一,目的条带非常不清晰,只有影子,边界不清楚,糊糊的,毛毛的,同样上样量的情况下,连成一条线,分不出一根一根的,抗体用新的试了也不见好,这是几个条带放在一起显影的图,没有一个清楚的。

        【专题讨论】多种WB条带问题,时好时坏,找不到原因,大家帮忙来!

        4,问题二,条带虽然比3的显影效果好了一点。但是,仍有些问题,同样是内参,对比1,就显得很差了,条带模糊不清,边界发毛,这是主要问题,泳道不清,有串孔,同样上样量,会连成一线。

        这个问题自从WB做的不好看以来,一直存在,出现概率跟高,换了新的样品,换了抗体,换了buffer,不见改善。

        【专题讨论】多种WB条带问题,时好时坏,找不到原因,大家帮忙来!

        5,问题三,最近连着出现了两次,这两次胶都是现配的,等干好了就跑。

        泳道里基本没有目的条带,但是大概在条带的KD位置,两个泳道之间的裂隙里出现了阳性杂交,像是两个孔的蛋白互相挤着了,把蛋白都挤到孔边缘了:

        【专题讨论】多种WB条带问题,时好时坏,找不到原因,大家帮忙来!

        上下是同一块胶跑出来的,上面是一张膜,没有出现“挤”的现象,下面这张膜就“挤”的不行了,在两泳道之间出现目的斑。并且可以明显的看出来,中间空的一个孔里被两边的蛋白挤满了,本身应该是像1条带里空着的。


        【专题讨论】多种WB条带问题,时好时坏,找不到原因,大家帮忙来!
        这张也是,泳道里没有,孔与孔之间里有蛋白的样子,最左边两孔是应该高表达的。

        越是在关键的时候,条带越是出不来,着急的!

        所有的buffer基本都换了,把自己的样品拿到别的实验室也跑了,结果人家的条带很清楚,我的还是糊糊的,感觉是从封闭开始,用的buffer不行,TBST重新配了,我们实验室用的是tris-base,用盐酸调PH值7.4-7.6之间,每次牛奶都是新配的,一抗二抗也新的,洗膜用的TBST都跟以前一样啊,哪里出了问题呢?

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