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        【原创】新人马上要做western,贴出protocol和每日步骤,一为求大神指点解惑,二可与各位同仁相互交流

        丁香园论坛

        1840
        新的不能再新的菜鸟,没有师兄师姐带,也没有实验室老师带,完全自己摸索,到各个同学那里蹭经验。马上要做western,故将总结的western经验步骤po上来,一为求各位坛子里的大神垂怜,可以给予指导解惑,二来,也可与各位即将做western的新人一起交流心得,分享失败教训经验。若有不当之处,还请各位前辈、同仁给予指出,叩谢。
        明日开始从提蛋白开始,今先po一部分步骤,明天晚上来汇报结果。

        一、细胞总蛋白提取:
        1、PIPA(碧云天)按100:1加入PMSF(碧云天),置于冰上备用;
        2、取25cm培养瓶(鼻咽癌贴壁细胞),4℃PBS清洗1min×3次,留1mlPBS,细胞刮顺方向刮下细胞,收集于2mlEP管中,2500rpm/5min,弃上清;
        3、加入200ulRIPA,置于冰上30min,中间反复吹打细胞;
        4、13000rpm/20min,4℃,取上清,10ul一管分装,-20℃冻存。
        二、BCA法测蛋白浓度:
        1、BCA试剂(碧云天)A:B=50:1配成工作液,4℃备用;
        2、用PBS稀释BSA,10ul至100ul,浓度为0.5mg/ml;
        3、96孔板内
        1(PBS+BSA) 2(PBS+样品)
        A 20+0 19+1
        B 19+1 19+1
        C 18+2 19+1
        D 16+4
        E 12+8
        F 8+12
        G 4+16
        H 0+20
        20UL 20UL
        4、各孔加入200ulBCA工作液,37℃,30min;
        5、测A562nm处OD值,绘制标准曲线,测定样品蛋白浓度;
        6、样品上样前处理:若为多种样品,则用RIPA稀释为相同浓度,加入5×LB(稀释至1×),100℃水浴加热3-15min,变性蛋白,-20℃备用。
        三、配胶
        1、组装制胶装置,加入纯水,定时10min,检查有无漏液;
        2、根据碧云天分离胶配置方法,配置分离胶(约5ml一块板),因我目的蛋白和内参GADPH在35-65kd,故选取12%配置;
        3、沿玻璃板加入分离胶至距玻璃顶1.5cm,纯水小心封闭,勿冲散分离胶,定时30min;
        4、凝固后,可见胶、水分离线,倒去纯水,倒置,吸水纸小心吸干;
        5、配置浓缩胶(约2ml一块板,两块板3ml也够),立即插入梳子,过程中不要产生气泡,20min胶凝固后,组装电泳内槽,加入电泳液后水平拔出梳子。
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