PCR扩增

PCR 是一个坑，坑里埋了好多研究僧……PCR 是众位「研究僧」日常实验中最常用的技术，可谓是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映，这道菜不好吃，一不小心就「小河里翻船」。那么，我们该如何把这道菜「吃好」、跳出这个「坑」呢？诸位看官莫急，待我送君「三大法宝」。一、确保 RNA 样本合格常见的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，这两个方法各有所长，但都不能保证提取的 RNA 样本一定合格。因而，提取完成后应测定 RNA 的浓度及吸光度。通常，在 260，280， ...

hanrui1009 小女子是新手，最近忙于做一个抗病基因的克隆，基因的片段大小7010bp左右，打算采用PCR的方法克隆，Taq LA polymerse和29bp的特异性引物，扩增不出来，请高手指点啊！zjubell 扩不出来太正常了。可能你的模板根本就没有，或者降解，或者表达很低。另一方面，这么长，聚合酶可能在中途就掉下来了。建议你分段扩增。比如分成5－10个PCR，每段扩600－800bp，设计一些overlap的区域。最好 ...

jerome520 我现在急做一批样本的microRNA检测（只检测一个指标），用茎环法，想要送去公司做。康成生物高手们有听说过吗？还有其他代做的公司推荐吗？谢谢！！！zaoyii 我知道广州伯信生物技术有限公司可以做，技术上也比较成熟，这是网站http://www.biosensechina.com/，你可以去看看或者打电话去问问：020-28069086jerome520 zaoyii wrote:我知道广州伯信生物技术有限公司可 ...

elainesummer 请问 鉴别某种细胞中有某个基因表达 是做PCR 还是做RT-PCR？elainesummer 为什么两篇文章一个用PCR 一个用RT-PCR 到底应该是哪个？还是两个都对？elainesummer 第一篇elainesummer 第二篇elainesummer 有人知道吗？elainesummer 顶啊！elainesummer 没人回答吗？nono1986 RT-PCR!elainesummer 人气好弱啊！本文由丁香园论坛提供，想了解 ...

liupeiyanxiaohai 小女子近来开始做chip，结果pcr后input的条带很亮没问题，只是阴性对照（加的是同种属的normal IgG）也出现了条带，而且和目的抗体的差不多，后来怀疑是交联时间太长（20min）随减为5min，10min还整了个没加抗体的做对照，结果还是加IgG和没加抗体的对照都有条带出现，怎样才能阴性对照没条带，还有就是超声怎样才能避免气泡的产生呢，每次超声都有大量气泡，求高人指点。实验 ...

linjl010 请问各位高手，我需要将1000多和2000多的两个片段连接起来，用重叠延伸PCR技术的方法怎么也连接不起来？（重叠碱基23个）总是扩增出1000多的杂带，没3000多的目的片段，原因可能是什么？希望大家给予指点！谢谢！devil19840 你做extension overlap PCR的多么？不妨将完整的实验方法列上来，包括每步PCR的步骤和回收的步骤、方法~23bp我觉得确实还是有些勉强，尤其你的片段长，如果 ...

ws 各位站友，本人因克隆某个植物抗病基因而完成了其BAC文库，目前正在做图位克隆的工作。但文库的完成耗费了大量人力、物力和财力，因此想请教下该库还有什么其它用途。或与其它技术结合，可开展什么工作。谢谢了。。。。zhujoker BAC (Bacterial Artificial Chromosome, 细菌人工染色体)文库是进行全基因组测序、构建物理图谱、染色体步查、基因筛选及图位克隆有益基因的最好材料，也是永久保存基因资源的最好方法之 ...

叮当儿 各位大侠，小妹要对HCE细胞的Toll样4受体做检测，但是细胞自身表达量太低，正常细胞提取RNA之后做逆转录都没有结果，而且我还要对其表达进行干扰，转染shRNA进去，结果就是做pcr时更没有结果了（内参很好），PCR反应条件如下：20ul volumcDNA loading 3ul10xtaq buffer 2uldNTPs(2.5/each) 2ulMg2+ 1.5ulprimer(F+R) 0.2ulTaq 0.2ulddH2O 11.1ul94℃ 3 ...

gaimong 有一个问题想请教一下大家：已知一蛋白N端和C端部分氨基酸序列，如何从基因组中将目的基因克隆出来，并对表达产物进行鉴定？查了一下资料，好像说用简并引物PCR可以，不过对这种方法不太了解，所以也不太确定。希望有高手能指点一下，谢谢bigbang_0_0 用简并引物屁一下cDNAholywater 太简单了，查NCBI blast.,,本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以 ...

第十七章　PCR及引物设计——【PCR版】已有ychhfl、wydsys报名 编写初稿，请及时奉上！第十八章　RT-PCR——【PCR版】已有yeang、swx_gene报名 编写初稿，请及时奉上！第十九章 实时定量PCR及其它PCR应用——【PCR版】--------------------------------------------------------------注：对PCR感兴趣的战友请到此跟贴！请申请的战友及时总结更新，每一专题暂限5名战友撰写，其他战友如有疑问请PM给原作者或我联系！ ...

我做了一点RACE PCR的工作，应lhailzhj 主任的邀请，在这里作一点介绍，望广大战友补充和修正，谢谢！近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种 ...

本人从事荧光定量PCR检测试剂的开发工作，用过市场上主流的多款荧光定量PCR仪，如ABI5700，ABI7700，ABI7000，ABI7300，ABI7500，MJ opticon，MJ opticon2，bio-rad ICycler，LightCycler1.5，roter-gene3000，line-gene等等。这种仪器各有各的特点，但都存在不足之处。总的来说，ABI公司的荧光定量PCR仪产品比较多，成系列，但目前而言A ...

一个PCR相关的专业网站，内容很全http://www.pcrlinks.com/实验方法与步骤详解http://swjsx.ntmc.edu.cn/Protocol/home.htm美国AXYgen公司http://www.axygen.com/NewFiles/pcr.htmlhttp://www.alkami.com/This 158 page PCR manual covers the following topicsPCR Primer designPCR M ...

荧光定量PCR仪在国内市场推广从98年开始已经经历了6年，从开拓者PE（ABI）到ROCHE,再到后来鱼龙混杂，各种荧光定量PCR仪纷纷登陆我国市场，使得中国市场成为世界上最为繁荣的荧光定量PCR技术应用市场，笔者由于从一开始就从事该项技术再中国的推广，就亲身经历的几种仪器来谈谈他们的优缺点，抛砖引玉使大家在应用这项技术的过程中提供一定的帮助。荧光定量PCR仪的鼻祖是PE7700（ABI公司推出）。而后从其进 ...

实时荧光定量PCR——一种科学准确的定量方法实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 ...

PCR技术：PCR片段拼接的SOE和SDL方法PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、 大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效 拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操 作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。SOE法　　1989年，H ...

PCR-聚合酶链反应的进展北京大学第一医院　朱　平　　在聚合酶链反应(PCR)的方法建立以前，面院DNA长链上某种基因的变化有很大难度。1983年由Kry Mullis 等利用当时已经发现的DNA聚合酶，首先建立的体外DNA序列扩增法，基本方法是用寡核苷酸引物扩增位于两个已知序列之间的DNA序片段。反应在DNA聚合酶催化下完成。引物的序列分别与模板基因的序列互补，分别结合在模板DNA对应的两条单链的目的基因的两端随着引物序列从5’ ...

经常看到许多战友因为PCR的非特异扩增而烦恼，不如我们把我们曾经也遇到过这样问题，经过努力后得到了目的条带的成功经验一起分享。首先我先把我的消除非特异扩增的方法先贡献出来，请大家多多批评指正。PCR类型：Long PCR一、PCR体系1、酶：Pyrobest DNA Polymerase2、模板：人类基因组DNA3、引物：根据已知的DNA序列设计的引物。4、目的片段长度：约3.5K（上述四项，我个人认为应当注明，因为许多PCR可 ...

最近一直在做基因组步移，看了些资料，步骤很详细，感觉可能会大家有帮助，如果遇到细节问题还可以进一步交流，现总结如下：用于Genome Walking Kit的模板总DNA 一般要满足以下几点：1、DNA 的完整性，电泳为单一条带。2、避免杂质，OD260/280=1.8~2.0。3、模板DNA 不要被污染。4、准确定量，不要少于3μg原理基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子)或下 ...

有战友做PCR-SSCP吗？下面是找到的有关PCR-SSCP的原理及具体的protocol，同大家一齐分享，希望对各位有所帮助！聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)　 聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。　PCR-SSCP ...