PCR引物设计

我以前在一家引物合成公司做技术支持，主要解答客户各种因为引物质量问题引发的实验问题），现在自己合成引物自己做实验用，对引物质量问题有了更进一步的认识，写出来跟大家共享一下吧，也让大家能判断什么时候是自己的问题，什么时候是运气不好碰上了小概率事件，什么时候是合成公司的问题。我也顺便整理一下思路，最近一个月一直看那些引物合成的文献，头都大了。现在引物质量问题主要体现在三个方面：1、pcr产物测序发现引物部分碱基错误 ...

我对引物设计的一些建议很多人都想学会引物设计及软件的应用，这些其实很简单，看看书大致原则就清楚了，但仍然很少有书介绍引物的设计流程，我将自己的一点体会在这里和大家交流。但愿初学者能有所收获。1．首先要明确设计引物的目的。是检测还是构建，是克隆还是表达，表达还分原核与真核表达之分。检测：一般说来，检测引物的设计相对简单。但若要求特异性，则需分析被检测的基因是否有高度同源性，这一般在引物设计完后在genbank上bl ...

文 / 屈武斌 (quwubin@gmail.com)多重PCR引物设计，一个重要的方面在模板序列的预处理，处理好了后面的引物设计将事半功倍。问题：假设我们要对6个模板（基因）序列设计6对引物，每对引物特异性的扩增特定的模板序列。针对这一问题，首先我们要设计6对引物，这6对引物要在一个体系中反应，因此彼此之间不能产生二聚体，最好它们的最佳退火温度相同，不能发生非特异扩增。要实现上面的目标，比较复杂，这里先从最基础的来说，即模板序 ...

我初次接触PCR，准备做转基因后体内表到的半定量RT-PCR。用primer和oligo设计了一对引物，在primer上二个引物都打了100分，产物98分。但是有人说软件设计的引物有时候得分很高也会做不出来，所以想请各位高手帮忙看一下。:)我对这对引物有两个疑问：1 下游引物以AAT结尾是否不太好？2 产物长度是213，是否太短了，跑胶不好看？Selected Primers-------------------------------------------------- ...

Primer Premier 4.10Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。这里我们主要介绍其引物 ...

我准备用Tagman探针做real time PCR,帮我设计一下好吗？我要设计三组，检测的是两个基因, 内参用P－actin，或GAPDH， 最好能参照你用过的内参引物探针.谢谢各位大侠快帮忙啊！急1）RNA (U50930.1:645..772, U50931.1604..1837)CDS U50930.1:712..772, U50931.1604..1749)agctcag cctccaaagg661 agccagcctc tccccagttc ctgaaatcct ...

一 设计引物应遵循以下原则：1 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。2 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和 ...

每次拿到生工的合成报告单，就要计算引物的溶解体积。所以写了个网页，可以做一个简单的计算，希望能用得上：其中分子量和OD值按合成报告单来；引物浓度按自己的需要来；其他两项自动计算出结果。代码：function Calc(){if(Primer.InputMW.value!=0){Primer.OutputMol.value=Primer.OD.valuundefined33/Primer.InputMW.value;Primer.Volu.val ...

文章题目：Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly-related sequencesNucleic Acids Research, 1998 Apr 1; 26(7):1628-1635.设计兼并引物的方法很多，但你听说过如何降低兼并度，以及如何提高成功率的方法吗？CODEHOP方法肯定是一篇这方面的精典文章！推荐出来，与大家共享！摘要：We de ...

大家好！我打算做半定量RT-PCR，把在文献上查到的引物（用来做实时定量）与GENEBANK里查到的cdna序列用PP5比较了一下，发现怎么好像不匹配？是不是我配的有问题？请大家帮我看看，谢谢！扩增产物有多长？CDNA:1 tggcgttgta tagttgggta cagcgaggct ggcgctgcgg tcagacgtgg gcgcctctct61 tgggtggcgg ctaccgggag ctctctgcga cccaggcccg gcag ...

我的基因的mRNA序列如下：1 atgaatggtg acacgcgggc cgcagtggtg acctcaccac ctccaaccac agcccctcac61 aaggagaggt actttgacag agtcgatgag aacaatccag aatatttgcg ggagaggaac121 atggcaccag accttcgtca ggacttcaat atgatggagc agaagaagag ggtgtctatg181 attctgcaga gtcccgc ...

我最近用一在线的引物设计软件设计了一对SD大鼠caspase-3 的引物,不知行不,请高手多多帮忙.结果如下:Primer3 Output--------------------------------------------------------------------------------WARNING: Numbers in input sequence were deleted.No mispriming library specifiedUsing 1-based sequence positionsOLIGO start len tm g ...

PCR 引物设计及软件使用技巧张新宇，朱有康，高燕宁（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编 ...

我要设计一个引物，扩增基因的CDS区全长，做蛋白表达，但是我比划来比划去都不行，两引物之间连续5个硷基互补，狂郁闷。各位大哥大姐，请不吝指教，救我于水深火热中。1 ccgcttagac aatgccccgg agccgccaga ccgtcgcgcc cctgccccat cgtagtatat61 gagctcgcct acacaaggac ccccgctaaa agccagagct cccagtcccc gaggcttgaa121 gacggggact cc ...

列位大虾：我是新手。准备扩增细菌基因的2100bp的基因序列，然后克隆、测序、E.coli表达，纯化，再做多克隆抗体。我用primer软件自己设计引物，总是有错配和二聚体，不知道该怎样设计引物？还有这么长的片段如果P出来后该选用哪一种质粒载体？根据什么选？测序用什么载体？基因序列：ATGACATTTGAAAAGCAAAAACACTTTAGTTTACGTAAACTAAAATTTGGTTTAGTTTCAGTTGCGA ...

各位大侠：本人初涉分子生物之列，现在想做一个融合蛋白，希能得到指点。问题之一：1 ccgccagatt tgaatcgcgg gacccgttgg cagaggtggc ggcggcggca tgggtgcccc61 gacgttgccc cctgcctggc agccctttct caaggaccac cgcatctcta cattcaagaa121 ctggcccttc ttggagggct gcgcctgcac cccggagcgg atggccgagg ctggc ...

我做heparanaser的RT-PCR,请各位帮助验证引物cDNA序列为:1 atgctgctgc gctcgaagcc tgcgctgccg ccgccgctgc tgatgctgct gctcctgggg61 ccgctgggtc ccctctcccc tggcgccctg ccccgacctg cgcaagcaca gcaggacgtc121 gtggacctgg acttcttcac ccaggagccg ctgcacctgg tgagcccctc gttcc ...

我设计了一对引物，用几个软件评价不一，哪位高手能否帮我检测一下？PA:ATCAAGCTTCACAGTCAGCCGCATGGPB:GCTTCTAGACCTCTGGCTGGCTTCTCAC我的序列：gcccgtacac accgtgtgct gggacacccc acagtcagcc gcatggctcc cctgtgcccc61 agcccctggc tccctctgtt gatcccggcc cctgctccag gcctcactgt gcaac ...

适用条件：RT-qPCR荧光定量。常用软件或网站：NCBI在线引物设计，IDT在线引物设计，sigma在线引物设计、primer3在线引物设计、primeprimer 5.0。根据我最近大半年来设计了无数对引物的经验来看，我想说的是，以上任何一种方法设计的引物几乎均可在一个较低的退火温度（例如52℃退火的三步法）下实现PCR扩增，只不过是扩增效率以及溶解曲线好与不好的差别。与其每次设计几个基因如果都从52℃开始摸索，且 ...

我要克隆一全长CDNA，设计引物如下sense:TCTCGGACCATGTCTCCCGCCCCA（起于104）antisense:CTA TCA GAC CTT GTC CAG CAG GGA（1841－1861）cDNA全长为：1 agttcagtgc ctaccgaaga caaaggcgcc ccgagggagt ggcggtgcga ccccagggcg61 tgggcccggc cgcggagccc acactgcccg gctgacccgg tggtctcgga cc ...