其他PCR技术

声明 ：本帖转自小木虫生物论坛 全文如下近看到很多人求关于分子克隆方面的视频，本人原来发的一个帖子也不怎么好用了，好像是纳米盘的问题，现再次把总结的视频发到网上，希望能给大家提供方便。（视频可以下载观看，本人亲测）感受态细胞的制备 http://u.115.com/file/dn6iwyka载体质粒的制备及鉴定 http://u.115.com/file/dn6iwx69染色体DNA的酶切与电泳鉴定 http://u.115.com/file/ ...

迷北方的狼 战友整理了5月上旬的0应助帖，我仔细看了一下，有很多都是因为提供的信息不够多，或者，可以在精华区轻松搜索得到答案的帖子。我将5月下旬的帖子整理一下，热心战友请积极应助:P整理过程中发现，不规范帖的0求助绝大多数是不规范帖。不知道本次整理会不会助长不规范帖的增长，希望不是！为了您的问题得到快捷和有效的解答，为了版面的整洁，请按规范发帖！另外，声明几点：1 留qq号而且标题也不规范的帖子没有整理。2 标题简单的写”求助 ...

增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端 ...

PCR基础分子生物学技术正以惊人的速度发展，特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分子理论基础。1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应（ PCR， Polymerase Chain Reaction ），使一向昂贵、繁杂、严格的分子生物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展，是基因分析技术的一项重大突破。这一技术 ...

近四个月来，我关于肿瘤系列实验设计方案的演变历程2003年9月25日，我完成了第一个实验设计方案“我的实验设计”，共有5个实验，是用化学致癌物做大鼠肝癌模型，实验的核心就是做支配肝脏自主神经的电生理参数测定，看看自主神经放电强度和正常对照组相比是否出现了显著性降低；如果实验组自主神经放电强度和正常对照组相比出现了显著性降低，那么，再比较自主神经放电强度降低出现时间和大鼠产生肝癌时间的先后，以明确因果关系。此前， ...

PCR常见问题总汇　PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。 ...

影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。　　一、温度循环参数　　在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退 ...

刚刚看到的文章，喜欢的话多多支持啊，请斑竹加分啊。LEAF PCR PROTOCOL(Klimyuk et al., 1993, TPJ 3: 493-494)1) Samples are harvested in 1.5 ml tubes and stored on ice.2) 40ul of 0.25N NaOH was added and the samples boiled for 30 sec.3) 40ul of 0.25N HCl then 20ul Tris mix was added and the samples boiled for another 2 min.-tissue samples can ...

扩增长目的片段当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶 ...

第一部分是PCRAbbreviations ixPreface xiChapter 1 An Introduction to PCR 11.1 Introduction: PCR, a ‘DNA photocopier’ 11.2 PCR involves DNA synthesis 11.3 PCR is controlled by heating and cooling 31.4 PCR applications and gene cloning 51.5 History of PCR 6Chapter 2 Understanding PCR 92.1 How does P ...

一、细胞裂解的准备(1)1×107 细胞重悬, 其来源可为新鲜样品或贮存于- 80℃ 1mo l 冰冻清洗缓冲液中的无DM SO 的样品, 冰冻缓冲液包括10mM HEPES (pH7. 5), 1. 5mM M gCl2, 10mM KCl,1mM 二硫苏糖醇(DTT ) , 然后离心(16 000rpm、4℃、1m in)。(2)重悬细胞团于100ul 冰冻裂解缓冲液, 其包含10mM T ris-HCl (pH7. 5) , 1mM MgCl2, 1mM EGTA , 0. 1mM 苯甲基磺酰氟(DMSF ) , 5mM B2巯基乙醇, 0. 5% CHA P s(Pierce) 和10% 甘油。(3)冰育30 分, 然后在超速离心机 ...

需准备的材料及试剂：1、DEPC水处理的EP管（1.5ml，1.0ml），Tip头2、玻璃平皿、镊子180℃烘烤6小时，以祛除RNA酶3、硝酸纤维素膜4、DigRNA labeling kit（sp6/T7）5、经分离纯化的线形模板DNA6、DEPC水处理过的无RNase 的0.2M EDTA，PH=8.07、RNA稀释用Buffer8、BufferⅠ9、BufferⅡ10、50×blocking11、Detection12、Dig 抗体及显色底物 ...

大肠杆菌克隆转化作为分子生物学的基础之一，具有广泛的应用性。并且，随着新技术的发展，大肠杆菌克隆转化操作变得比以前更加简单易行。下面，我将以结合自己研究生对于这个体系操作的经验，对于现行的大肠杆菌操作体系进行一定的优化，希望能够给大家节省克隆转化的时间以及提高成功率。一般来说，克隆转化从开始到结束分为获取基因，设计引物，PCR基因，酶切，连接，转化，菌落PCR以及挑取克隆酶切验证几个步骤。下面我将根据时间顺序，对每 ...

以下每一个试剂盒都有实验步骤，操作说明及结果图片等，3年反复实验的成果。因JPG, GIF, PNG 图片过大，不能上传，如有需要请发邮箱dushengbiotech@163.com，说明需求，即有回复，欢迎技术讨论及咨询。1、Nova Taq DNA Polymerase（聚合酶）2、Nova Pfu DNA Polymerase3、Nova Kod DNA Polymerase4、Nova Extra-Kod DNA Polymerase5、Nova Tth DNA Polymera ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq 敢种 剂，③模板中蛋白质?有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时， ...

PCR问题及解决内容：Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292Developing a PCR Strategy: The Project Stage . . . . . . . . . . . . . 293Assess Your Needs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293Identify Any Weak Links in Your PCR Strategy . . . . . . . . . . 295Manipulate the Reaction to Meet Your Needs . . . . . . . . . . 296Developing a PCR Strategy: The Experimental Stage . . . . . . . 296What Are the Practical Cr

质粒提取原理（别人的总结）碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此， ...

过去的几年里人群中肥胖症患者的比例急剧升高。因此对脂肪细胞---脂肪组织的基本组成单位---功能的研究也不断升温。这其中大多数的研究通过从脂肪组织中提取少量的RNA来检测参与代谢调控的低丰度基因表达水平。就小量RNA的检测而言，与传统的RNA定量检测手段（如RNA印迹分析）相比，逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)更为灵敏。实际上，这一技术足以定量单细胞的RNA水平。qRT-PCR应用的主要限制因素是结果的高不稳定 ...

PCR常见问题总结PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核 ...

RACE使用对象http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2785112_0.htmlRACE原理http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=1342728&sty=3&keywords=RACEhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/806243_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/thread ...