其他PCR技术

充分的准备是实验成功的关键，那么，qPCR 实验需要提前做好哪些了解呢？试剂的储存条件市面上大多数 qPCR 试剂推荐 - 20 ℃ 避光长期储存。Vazyme 的 ChamQTM 和 AceQ? 两个系列的 qPCR Master Mix，长期储存应置于 - 20 ℃ 避光，解冻后可于 4 ℃ 短暂存放；避免反复冻融。原始模板稀释倍数—是不是拿到一个 cDNA 模板就直接做 qPCR？—NO!—是不是拿到一个 cDNA 模板就直接做 qPCR？—NO!—是不是对怎么确定稀释倍数倍感无助？……尽量选择 Ct 值落在 15-28 范围的稀释倍数作 ...

人人都爱小勇哥 我提取植物基因组DNA ，并设计引物进行PCR反应，但是出现弥散现象，弥散部位很很亮，然后我进行胶回收，在切胶过程中切取较量部位，然后进行回收，电泳检测发现仍有弥散。不知道是怎么回事，希望各位高手给予指点，谢谢！！lifz2001 弥散原因很多，贴个图看看。体系？反应条件讲清楚？wangch84 降低引物浓度和模板投入量本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的 ...

laide 各位PCR高手：本人新手，想要用PCR的方法，用高保真的DNA聚合酶扩增一段长度为2700bp的DNA，用于基因克隆。但本人担心PCR后产物片段可能突变。由于没有做过，我想实验前预先评估一下整个实验的风险。故向各为有经验人士请教，用高保真的DNA聚合酶扩增，能否保证2700bpDNA不突变？还有哪些可行的措施可以保证整个PCR过程的保真性？欢迎各位高手赐教。济南基美 循环数不宜太多，突变在PCR中是积累的。 ...

lvxue1021 我分两次提的心肌的RNA，同是我的空白组。然后PCR、电泳，但是电泳后的目的片段长度第一次在200bp左右，第二次在300bp左右，而200bp左右的才是我要的目的片段。到底是怎么回事啊，大家有没有遇到过这种诡异的事情。ningmeng1119 理论上不会出现这样的情况，你再做一次看看结果怎么样，中间的操作有没有什么不一样的？lvxue1021 操作都是一样的。第一次做的一个样，因为第一次做，比较精细，第 ...

wj1989113 最近在构建一个质粒。根据我的目的基因序列，筛了两个酶切位点，而且只有这两个酶切位点能用，XbaI和EcoRI,设计引物时XbaI 加了两个保护碱基，EcoRI 加了三个保护碱基。根据takara公司的说明，选择了共用Buffer1xM,酶切，连接，转化之后挑克隆，抽质粒酶切鉴定，发现都是空载体。网上说XbaI对甲基化敏感，有什么对策？因为我别无他选，只能用这两个酶。不胜感激！！！gisang 双切之后跑电泳了吗，有 ...

biokook 如题，谢谢大家了。zjubell biokook wrote:如题，谢谢大家了。你要做什么序列分析？mapping? denovo?大部分优秀的高通量序列分析软件全是在linux下的velvet, soap, bowtie, etc，还没找到有多少是windows下的biokook zjubell wrote:你要做什么序列分析？mapping? denovo?大部分优秀的高通量序列分析软件全是在linux下的velvet, soap, bowt ...

saga2230 最近一周做的rt-pcr实验，动物肝组织提取RNA。结果β-acitn出现了杂带。这是第4次重复的结果，之前的结果都很好，只是这次有杂带。可能是样品放置时间过长了，肝组织在-40冰箱里未加其他试剂放置20天左右。其中的原理好像很复杂，这个我没有专门学习过。问了周围人，有3种说法，1二聚体，2特异结合，3杂dna引入，但都说的不清楚，只是说有可能是这样的。。谁能帮忙分析下是什么原因啊。。。westernblo ...

shengmaolin 各位大侠，小弟有个问题想请教。NF-KB p65能不能做RT-PCR？怎么在Pubmed的Nucleotide上找不到人的NF-KB p65的核苷酸啊！找一个药商帮设计的上游引物：5’- GGGATGGCTTCTATG-3’ 下游引物：5’- GTTTCGGTTCACTCG-3’，查了下好像不对。到底怎么搞的我也不清楚，请各位老师指点！谢谢！shengmaolin 帮帮忙，大侠们！brucewu1986 是不是人的p65啊p65 ...

lmllml 这个是我今天跑的很失败的普通PCR结果。我是一个新手，所以···实在很失败cDNA做的PCR，反应体系是塔克拉的，那种非预混的酶体系胶是2％的可是结果，这些条带很奇怪···求教高手···万分感谢！yuzhiming 电泳液换新的。胶浓度不要那么高。0.8-1%即可！lzrzrl 是不是电压的问题knightkidd 应该是电压的问题，电压或者电流太高了把，我也出现过类似情况，跑慢点就好了！orforu 缓冲液的问题wanchua ...

琼琼qiongqiong 请问各位：买抗体和PCR试剂哪个公司好点？？？希望大家多多推荐，我是新手，没有经验！先谢大家 啊。biolinkphilic 这个看经费和采用的研究手段，以及对结果的要求综合起来再做决定吧。noforever_hh 我们的购买抗体做法是：1；实验室如有人用过，效果不错，就沿用。2；没人用过不了解，就查文献，级别高些的文章，看人家的结果，然后参考他们的试剂选择的公司。PCR的试剂现在很成熟了，几个大公司的都不错， ...

zhanghai123 大家好！我最近在做测定一种GPCR是否会引起细胞内钙离子浓度波动的实验。我是用共聚焦去测定，通过C3染料来检测。请问，在GPCR被配体激动后，假如我的GPCR是偶联Gaq的，一般多长时间就可以引起细胞内钙离子波动？我是直接在共聚焦上先用含钙PBS去测基线，之后洗掉PBS，直接加含药的PBS，然后开始测，5秒钟测一次。不知道这样时候正确。谢谢高手指教！kern6549 共聚焦检测很难实现定量，不适合 ...

泌外医师小李 在培养液中加入a蛋白质可以提高骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的分化率，但a蛋白质使用周期长且价格昂贵，请用基因工程解决这个问题。小弟无才，在此请教各位高手，望不吝赐教，谢谢！woxingwosu 估计是要自己克隆表达蛋白吧。zhujoker 你如果是应试，在这儿找不到什么好的答案的。这个问题你还不要说，即使是做原核表达，还不定能够做到你想要的那种纯度以及质量，建议你如果不是专业性的实验员，你还是在其他方面省省， ...

sissiwubing 请问哪位高手知道LA-PCR是什么？zjubell Long and accurate polymerase chain reactiontakara的目录做的比较好，有这些介绍的。不妨去看一下。另外，请不要随意用‘哪位高手知道’这种话我是菜鸟，但是会用GOOGLE，就完全可以回答这种问题了。sissiwubing 看来你是自认为高手才进来的了，菜鸟zjubell sissiwubing wrote:看来你是自认为高手才进来 ...

dxyqxl 麻烦问大家一下，构建载体时，何谓正向插入与反向插入啊，两者有何区别，跑胶以后的片段长度应该是一样的吧？谢谢各位啊！slytjiaofei 载体总的大小一样，但经过酶切后产生的片段长度有区别，不然怎么鉴定是正向还是反向，有的载体只有方向正确了才能进行下一步的转染表达，建议还是多看点相关的文章！阿呆硕士 一般的克隆型载体，其方向性就不是特别重要了，它关键的是目的片段的一个载体，最典型的没有方向性的就是T-A连接了。 ...

yinfengzhizi 我需要做QRT-PCR，想用U6做内参，研究的标本时牛，可是我在NCBI的nucleartide上一搜，发现一下子出现好多，长度和序列也不同，不知道该选用哪一个。是查的方法不对么？还是需要再做些什么工作？望高手指点！zhujoker 你需要选择一下物种，要不的话你就看不清到底是什么了yinfengzhizi 我查的是牛的，用了cattle U6 snRNA,出来9个结果，长度不同，且用软件分析同源性，只有一 ...

cypress1975 克隆100个已知序列的基因于带有绿色荧光蛋白的载体中需要多少时间和经费？非常感谢gingivalis 方法：在NCBI中搜索下面的关键词，能在《methods in molecular biology》系列丛书中找到很多文章。high throughput cloning methods in molecular biology时间估计不会太长。关键花时间的是克隆以后的工作，表达，活性分析。钱，不知道，多多益善。版主freece ...

flowriver 新生，第一次来发帖，请教：PCR做出加药后上调的趋势，但是Western却是下调。应该怎么解释呢？如果能附上相关文献的检索就更好了。谢谢！！！freecell 在回答这个问题前，请楼主回答几个问题：1、你的“PCR和Western的结果不相符”这个结论，是重复几次试验后，观察到的结果？2、你的PCR样品和WB样品来自体外还是来自体内？3、你的PCR是常规PCR，还是定量PCR，还是定量RT-PCR？4、你的PC ...

maiqitu 在构建载体的时候要往里面加rabbit beta-globin intron，请问是为什么呢？谢了啊zhujoker 那你到底是构建什么载体啊？还需要往里面加rabbit beta-globin intron，我也觉得奇怪。但是有一个东西是可能的，那就是你构建的是miRNA表达质粒，因为miRNA位于大多数基因间，也就是位于内含子得地方？不知道是不是你所想要的，呵呵！hcai55 恩，miroRNA表达载体有些是这样。比如 ...

xiaomao1260 各位战友，小弟刚入行，读文献时看见两种试验方法:减除杂交和表象差异分析法。想各位请教这两种方法的实验原理，基本步骤，和用途。谢谢！freecell 请提供相关名词的英文名称。xiaomao1260 减除杂交subtractive hybridization表象差异分析法representational difference analysisziyunfei 中文翻译是消减杂交，是一种以PPCR subtraction ...

伽利略 假设PCR后6倍，能代表初始量mRNA就是6倍么？有人说能，有人说不能，谁能来解释一下呢？我一直都想不清楚，但是国外文献确实有直接说就是几倍几倍的如果RT PCR不能，那么REAL TIME的能么zhao22840718 在引物设计非常好的情况下，指数扩增时能代表，如果循环数过多，后期就不是指数扩增了，自然就不能代表了。灰度扫描能不能代表真实的倍数，我就不清楚了。real time分析的是指数扩增期，应该能代表。个人看法。伽 ...