Real-Time PCR

qPCR 曲线异常问题通常分为两大类：扩增曲线异常、融解曲线异常。扩增曲线异常这个问题可能涉及到多种原因，主要可以归结为以下 6 种：（1）扩增曲线不光滑主要有两个原因，一是扩增信号太弱，经系统矫正后，就产生这样抖啊抖的线，小 V 建议大家提高模板浓度重复实验。二是仪器本身的问题，可能在扩增过程中仪器出现了波动或者本身该检测孔出现了异常。（2）扩增曲线断裂或下滑比较典型的曲线下滑如上图所示，主要原因是模板浓度太高了，在基线期内就起峰了 ...

jiang104820 请问各位样本在负80度放了一年多，对荧光定量PCR的结果会不会有很大影响啊？我前几天做了荧光定量PCR，对照组的样本是新收的组织，而实验组的样本是一年前收的，跑出来的结果几乎所有指标都跟表型相反，很郁闷啊！求解答！谢谢shylook 跑PCR看看rna降解没jiang104820 shylook wrote:跑PCR看看rna降解没负80度储存是组织块形式储存的，RNA是我做PCR的时候提的，测浓度 ...

nvonne 我购买的miRNA mimic 带FAM标记，本打算用流式检测转染效率，但发现荧光信号很弱，转染后采用定量PCR检测miRNA的表达变化，相对定量分析，发现mimic组比NC阴性对照组的miRNA表达量提高了100多倍，这虽然表明转染mimic成功，但总感觉这么高的变化有点太离谱了是不是？也没查到相关文献，谁能给我一些参考？非常感谢zhujoker 顺转就是这么高，我的也是这样，有的能够上调1000倍nvonne ...

yuanliang0828 请问real time PCR与RT PCR有什么区别？我想在不同时间点验证某种蛋白表达增多，可以用RT PCR吗？baby_susan RT PCR 从名称上讲 可以是real time PCR的缩写，也可以试是反转录PCR 的简写另外real time PCR和反转录PCR区别主要区别是，前者可以定量，后者只能定性看看你某种蛋白的表达增多还是减少，存在不存在，不能看出增多或较少多少melody405 real time PCR又叫Q-PCR， ...

leileicui 在看文献是发现这些问题：miR-23a RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACggaaatPCR sense GCGatcacattgccagggThe same antisense primer was used for all miRNA PCR : GTGCAGGGTCCGAGGT（问题，1所有的miRNA序列可以用同一个反义序列吗？问题2：这里的正义和反义引物是不是就是其他文章中提及 ...

mushuixiaotaozi 麻烦问一下大家，如何分析real time PCR的结果，用的是SYBR Green的方法，做相对表达量的分析。结果怎么作图怎么描述？升高或者降低的倍数达到多少才有意义呢？wangke80 这个问题你查两篇国内或国外文献就知道了，或者直接百度一下。简单说就就是运用2-deltadeltaCT运算最后的结果和作图。不在于升高或降低多少倍数才有意义，而是统计是不是有意义。mushuixiaotaozi 我 ...

xueer8847 请教：Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.这篇文章的出处“Nucleic Acids Res, 2005, 33(20): e179.”中的e179代表什么，有谁知道这篇文章的起止页码的啊？谢谢！zhujoker e179代表其在那一期的序号，也就是说这篇文章在那一期为e179，原文附上xueer8847 多谢！：）dnazyme 其实这个杂志很特殊，e代表比期更小的一个单位，比 ...

Publisher: Taylor & FrancisNumber Of Pages: 333Publication Date: 2006-06-13ISBN-10 / ASIN: 041537734XISBN-13 / EAN: 9780415377348Binding: Paperback--------------------------------------------------------------------------------Book Description:The BIOS Advanced Methods series is intended for ...

Rt-PCR实验步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、 ...

REAL TIME PCR一 ：引物的设计引物的设计对于这个实验至关重要，因为 real time pcr 的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是 SYBR 照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。2，引物的特异性一定要高（不像常规 PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。real ti ...

2009年就这样过去了，2009年的下半年我一直在跟RNA提取、逆转录和SYBR GREEN realtime-PCR反应做斗争，现在已经告别当初的迷茫，当别人问自己的时候，也能说出个一二五来了，很高兴。当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把一个初学者最初的想法和觉得矛盾、困难、不知如何入手的方法、难点和最后解决的办法写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了，三就是希望版主 ...

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct ...

real-time PCR:http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=107005&sty=1&tpg=61&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=225218&sty=1&tpg=57&age=0http://www.dxy.cn/bbs/thread/190819http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=641204 ...

正在着手做real-time PCR的朋友们，我想最开始肯定要考虑引物设计的问题。看完下面的文字，我保证你得到想要的引物设计方法和引物序列。第一步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告诉我你不会找序列。如果真的不会，请参考丁香园内其他版块，如NCBI使用，序列查找等。第二步：确定你想用哪种方法。Taqman Probe还是SYBR染料？两种方法各有利弊，这里不赘述，不明白的依然参见其他版块。但需要指出的是，后者在国内更常用，因 ...

多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。1 实时荧光定量PCR技术的方法学1.1 原理 所谓real ...

昨天找出了这篇关于Real-time PCR数据统计的文章，被引用了1000多次Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method Methods. 25, 402, 2001.Abstract:The two most commonly used methods to analyze data from real-time, quantitat ...

先谈引物设计原则，再讲实施方法。引物设计不仅对引物有要求，也对PCR target有要求。Design guidelines for primers:Primers:1 length18-242GC content35%-65%(ideally 40-60%)3Tm60-70°C (ideally 65°C), so that annealing temperature is 58-62°CΔTm (forward primer and reverse primer)

Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知 ...

这是我目前见到的关于real time的最全诠释的书籍。也很新，是2006年的。我基本上已经读完，获益匪浅。目前自己的试验涉及这个方面。希望与大家多交流。我在园子里搜到有人发了这篇文章的网址，不过还是有不少朋友打不开。我把它的pdf放在163邮箱里了，用户名：dxy1_2009@163.com密码：dxy123456。需要的朋友直接下载就行。能不能给加分也不重要，重要的是对大家有用。不过要是能有一分的奖励，那就更高兴了 呵呵 ...

看到很多关于RT-PCR的求助贴，而且都是围绕那么几个问题。结合自己做RT-PCR的一些经验，先做个总结，不足之处请各位大虾补充。希望能够抛砖引玉，呵呵。1.RT-PCR时，内参能出来而目的条带不出来的可能原因：(1)RNA部分降解了。很多人都把内参作为判断cDNA模板质量的一个非常重要的标准，认为内参能出来那么cDNA一链质量肯定没问题。但我一直都认为，内参能P出来，仅仅只能说明RT成功了，但与cDNA一链的质量并 ...