RT-PCR

“实时荧光定量PCR仪原理及仪器操作实训班”第一论通知实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已广泛应用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。为了充分提高荧光定量PCR仪的使用效率，提高广大使用者的试验成功率，我们将于10月23-24日举办《荧光定量PCR仪原理及仪器操作》实训班。培 ...

RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2RT按要求做，一般不会出太大问题。?3PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法 ...

Validation of a quantitative method for real time PCR kineticsAbstractReal time RT-PCR is the most sensitive method for quantitation of gene expression levels. The accuracy can be dependent on the mathematical model on which the quantitative methods are based. The generally accepted m ...

看到论坛上有很多朋友询问RT-PCR的重复性问题，说明这里面还是有很多问题的，于是 想跟大家分享一下自己做PCR的经验：1. 总RNA的提取： 材料来源一般为细胞和组织，细胞相对比较单一，蛋白污染较小，TRIZOL法提取结果 A260/A280 结果一般都在1.8-2.1之间；组织的成分较复杂，污染多，提取较纯的RNA有一定难度, 我觉得以下地方需注意：1）最好新鲜取材，不能马上做的标本可以-70度保存，短时间内也不会有什么影响。2）研磨的手法 ...

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异 ...

近段时间在“PCR技术讨论板”有不少关于RT-PCR引物设计的求助，所求助的引物有相当部分都是用于检测某一基因的表达的。其实，对于很多基因而言，用于检测其表达的RT-PCR引物已早有文献报道，我们完全可以利用这些已有的资源。我们所需要做的只是找到这些已发表的引物序列，通过Blast验证其是否正确、确定其特异性，用软件分析引物的好坏后直接使用就可以了。下面介绍2种搜索引物序列的方法，希望对大家有用。1. 通过搜索基因来 ...

一、RT-PCR1. cDNA产量的很低可能的原因：RNA模板质量低对mRNA浓度估计过高反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足同位素磷32过期 反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系与反应起始时RNA的总量及纯度有关建议在试验中加入对照RNundefined第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系 ...

做了快一年的SYBR G的定量实验了,有一些心得,写出来大家交流下.也是今天在学校的BBS上有人推荐这里的,觉得很不错.我们用的机器是ABI 7900,我自己比较喜欢的试剂是ABgene的QPCR sybr ROX MIX.undefined试剂我一般再进行稀释一倍后使用,反应总体系是10ul.用SYBR G来做的话,引物非常重要.我设计引物使用Primer 5,一般选择上游引物跨最后和最后第二个外显子,下游引物在最后一个外显子中,实在找不到,可以前移, ...

Access RT-PCR System (Promega)DescriptionPromega’s Access RT-PCR System (a) is designed for the reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) amplification of a specific target RNA from either total RNA or mRNA (1). This one-tube, two-enzyme system provides sensiti ...

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b ...

近来做2个基因的半定量分析，对RT的中RNA的用量问题一直没搞得很懂，也没有权威的资料可供参考，在园子里Search 了很久也没有得到理想的东西，无意中在生物谷得到了下文，虽然没有权威的出处说明，但也颇受启发，遂转来供正在做RT-PCR并和我一样处于郁闷的同仁们分享：http://www.bioon.com/experiment/pcr/pcr5/Index.htmlRT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：1.做 ...

问题1： 第1条cDNA链产物产量低或没得到可能的原因：1 RNA被降解（建议：通过变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性；2确保试剂、加样器尖头及反应管均无RNA酶。在有核酸酶抑制剂（如Promega公司的rRNasin® 核酸酶抑制剂）存在的情况下分离RNA。）2 AMV反转录酶被高温灭活（建议：如果在实验方案的开始加入了一个变性/退火步骤，则应确保在变性步骤及此后的48℃恒温之后再加入含有AMV反转录酶的酶混合物。）3 引物的特异性 ...

Technically SpeakingAccess RT-PCR SystemBy Patrick BurkePromega CorporationTranscription of RNA from DNA is the principal step in executing a cell's genetic program. Numerous techniques have been developed to investigate gene expression at the level of transcription, incl ...

1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因：1）RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT ...

Access RT-PCR系统1)什么是Access RT-PCR？2)什么是Access RT-PCR系统？3)总RNA能否作为模板，是否一定需要poly(A)+RNA?4)使用Access RT-PCR系统需要的RNA的量是多少？5)同一般常用方法相比较，Access RT-PCR系统有哪些优点？6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件？7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力？8)为什 Access RT-PCR系统不使用MMLV反转 ...

生物谷： RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9me ...

生物谷： RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9me ...

各位大虾：我做巢式PCR，内外侧引物条带均不对，作了N次，还是找不道原因，请各位帮忙分析。1、引物：The fisrt pair primer:5'primer:5'CAC TAG AAT GGG CAA CTG GTA GC3'(2-24nt)3'primer:5'CCG AGT ATA CGC ACA ACG CA3'(937-956nt)The second pair primer:5'primer:5'GCC GAA TTC ATG CTC CTA TCG CGG ATT3'(ECORIsite)3'primer:5'GAC CTC ...

我最近设计引物有些困难，我要扩增EBV的BNLF1基因(编码LMP1)的cDNA,两引物各带EcoRI、BamHI 的酶切位点，但是两者的Tm值相差太大，实验时间紧迫，望各位高人替小女子改一改。无限感激！！！！！此致敬礼！！！EBV（B95-8序列，Genebank Acession NO.V10555，1999年）的LMP1的编码基因BNLF1的基因序列（只给出内含子、外显子的序列）：Exon1:169207-169474nt（267b ...

Protocol for competitive RT-PCRFor quantifying mRNA, we use a competitive RT-PCR protocol with internal standard RNAs. These are added in a defined quantity to the RNA sample prior to the RT reaction. The resulting standard cDNA is coamplified with the same primers as the endogenous target seq ...