免疫细胞与组织染色实验

如何获取与组织细胞功能相关的各种定量测量信息是免疫组织（细胞）化学的一大难题。制作免疫组织（细胞）化学标本环节较多，只要有一个环节失误就会影响实验结果，除了需要精制的药品外，还需要熟练的技术。那么，做成理想的标本后，如何进行观察才能获得尽量多的的各种定量信息，而且使这些信息能较客观的反映出来，这就是本文的写作目的。 一、定量分析的重要性 目前有许多研究免疫组织（细胞）化学的文章，是做定性和定位研 ...

一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究 ...

1、洗载玻片 将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右），再将载玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37 oC温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。 2、包埋组织 先 ...

许多实验室研究人员习惯将组织蜡块切片后长期保存在室温条件下，而切片后的组织在室温下长期保存抗原易损失。 一些研究发现，切片在室温下保存3个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱，甚至阴性。因此，有学者进行了新、旧切片保存时间对照实验。选择11种不同组织蜡块每例连续切10片，共110片，常温空气中放置1个月、3个月、6个月、1年再与新切片进行对照实验。实验结果表明，蜡块切片后室温保存3个月，抗原对多数抗 ...

一、脱蜡和水化 方法同SP法。 二、第一抗体的染色 1、将切片浸在3%H2O2甲醇溶液（新鲜配制）中10 min，PBS冲洗3 min×3次； 2、加100 ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10 min，倒掉（不能冲洗）； 3、加入一抗（按照说明书推荐浓度和孵育条件）； 4、使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)，冲洗5 min×3次； 5、加 ...

1、4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）过夜，蜡块制作，切片，贴片。0.01 M PBS清洗5 min×3次； 2、脱蜡、水化：用二甲苯两次10 min，用梯度乙醇由低浓度到高浓度进行水化； 3、加入0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80 ml＋0.01 M PBS 100 ml＋30%过氧化氢）30 min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01 M PBS清洗5 ...

1、石蜡切片置于60 ℃烘箱中，烘片2 h，脱蜡至水，用PH7.4的PBS冲洗三次，每次3 min（3×3'）。 2、取一定量PH6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10 min，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3'。(注：不是 ...

SP(streptavidin-perosidase)法，即链霉菌亲和素-过氧化物酶法。按标记物质的种类如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素- ...

A modification of the basic immunofluorescence staining and flow cytometric analysis protocol can be used for the simultaneous analysis of surface molecules and intracellular cytokines at single-cell ...

一、组织处理 恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。 1. 组织及时取材和固定 ...

由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术 ...

一、免疫组化技术的基本原理 应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫 ...

制备好免疫胶体金后，还需要将其稀释到一定浓度，并吸附于特殊的惰性介质中才能够最终制成产品。一般来说，特殊的介质常用的是玻璃纤维或无纺布。玻璃纤维和无纺布本身一般是疏水的，胶体金产业一般采用表面活性剂预处理过的玻璃纤维或无纺布，通常配方为1%Tween20+适量PVA。介质处理完成后，免疫胶体金稀释液的配伍才是最关键的。现总结原则如下： 1、合适的离子种类和强度 免疫胶体金毕竟是含有生物活性分子，应 ...

一、基本原理 免胶体金检测技术是用金属离子和金属蛋白复合物应用免疫组化原理检测组织内抗原抗体的技术，常用胶体金（铁、汞等）重金属离子。由于胶体金容易制成各种大小的颗粒且有很高的电子密度及分辨率，又不影响抗体的活性，因此既可用于免疫组化又适于免疫电镜技术。 二、操作步骤 1、脱蜡至0.05 mol/L TBS PH7.4缓冲液。 2、抗原修复。 3、1％卵蛋白（EA）15 min，不洗。 4、特异性 ...

一、免疫胶体金技术的基本知识 ㈠ 胶体金的概念 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 ㈡ 免疫金标记技术 胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。胶体金对蛋白质有很强的吸附功能，蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面，无共价键形成，标记后大分子物质活性不发生改变。 ㈢ 胶体金的 ...

1. 产生非特异性染色的主要因素 （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以 ...

一、材料和试剂 1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。 2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。 3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。 4、0.01M PH7.4 PBS 5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20） 6、AEC底物 （1）底物缓冲液（20X） PH 4.6 醋酸（分子量60.6） 30.6ml ...

一、材料和试剂 1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。 2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。 3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。 4、0.01M PH7.4 PBS 5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20） 6、AEC底物 （1）底物缓冲液（20X） PH 4.6 醋酸（分子量60.6） 30.6ml ...

免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究的一种方法。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度 ...

一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要但对表达较弱的抗原可能有用4度和37度时分子运动方式不同前者分子碰撞机率和运动速度小于后者后者结合更快但敏感性也提高了并易造成非特异染色。（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过 ...