免疫细胞化学常用试剂介绍（3）

一、粘附剂

在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常影响工作的质量的速度，故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。

1、铬矾明胶液

试剂：铬矾　　　　　　　 　0.5 g

　 　 明胶（Gelatine）　　　 5 g

　 　 H2O　　　　　　　　　 ~1000 ml

方法：在1000 ml的烧杯或烧瓶中，以500～800 ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70 ℃。如有明显残渣，过滤后使用。

2、甲醛-明胶液

试剂：40%甲醛　　　　　　2.5 ml

　 　明胶　　　　　　　　0.5 g

　　 蒸馏水　　　　　　　至100 ml

配制方法：用少许蒸馏水（约80 ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100 ml混匀即可。

3、多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）

试剂：多聚赖氧酸　　　　　 5 g

　　蒸馏水　　　　　　 ~1000 ml

配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4 ℃保存，也可-20 ℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。

4、Vectabond试剂　　该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。

一个试剂盒（7 ml）可配成350 ml工作液（用丙酮配）。处理载玻片前（事先酸处理），用染色缸装好各种液体，按下列程序进行：

干净载玻片→丙酮5 min→Vectabond试剂工作液（7 ml Vectabond+ 350 ml丙酮）：将载玻片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1～2次→dH2O，2×5 min→干燥（37 ℃过夜）→用铝箔包好，室温存放备用。

注意：避免污染（尘埃等）；综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。

二、封固剂

1、甘油-TBS及甘油-PBS

配制方法：按比例将甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4 ℃，冰箱静止；待气泡排除后方可使用。

2、甘油-明胶（冻）

试剂：明胶　　　 10 g

　 　甘油 　　　　　　　12 ml

　　 蒸馏水　　　　　　 100 ml

　　 香草酚　　　　　　 少许

配制方法：称取1 g明胶于温热（约40 ℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12 ml甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。

3、液体石蜡　液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。

4、DPX

试剂：Distrene 　　　 10 g

　　 酸二丁　　　　　　 5 ml

　 　二甲苯　　　　　　　35 ml

DPX为中性封固剂，用于多种染色方法匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售，可直接应用。若感过于粘稠，也可加少量二甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上出现许多干燥的空泡，影响观察，遇有这种情况，可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。

六、酶消化液

1、0.1%胰蛋白酶

试剂：胰蛋白酶 　　　　　            0.1g

　  　0.1%氯化钙（pH7.8）　　　100ml

配制方法：先配制0.1%的CaCl₂，用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度）。该消化液时间约为5～30min。

2、0.4%胃蛋白酶

试剂：胃蛋白酶 　　　　            　400mg

    　　0.1N HCl　　　　　　　　 100ml

配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。

3、0.06% Pronase

试剂：Pronase　　　　　　　         0.06g

　  　 0.05mol/L TB（pH7.5）　　 　100ml

配制方法：同前。

在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。

七、其它

1、蔗糖溶液　　免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为5%～30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。

（1）20%蔗糖液：

试剂：蔗糖 　　　　　　　　　             　20g

　    　0.1mol/L PB（pH7.5）　　　　 　　至100ml

配制方法：先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/L PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。

该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。

（2）20%蔗糖-5%甘油：

试剂：蔗糖　　　　　               　 20g

　　   甘油 　　　　　　　　    　5ml

　　  0.1mol/L PB　　　　　　至100ml（约95ml）

配制方法：先用少许PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB至100ml，于4℃保存备用。该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右）。蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较广。