抗体抗原实验

一、简介 1、目的 构建和表达抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体，并测定该微型双功能抗体的生物学活性。 2、方法 采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3/抗CD20微型双功能抗体，并用双脱氧终止法测定DNA序列；采用亲和层析法纯化该产物，并用Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物；采用免疫荧光法、放射免疫分析法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。 3、结果 DNA序 ...

一、摘要 1、目的 构建抗CD20嵌合抗体Fab'和F（ab）2片段表达载体，并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达，比较二者的活性差异。 2、方法 从相应的杂交瘤中提取mRNA建立抗CD20 ScFv 噬菌体显示文库，利用PCR方法从阳性克隆扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（VL）、重链可变区基因（VH），重组到表达载体pYZF1，构建抗CD20 Fab’和抗CD20 F（ab）2达载 ...

一、Bispecific antibodies introduction Bispecific antibodies usually do not occur in nature but are constructed by recombinant DNA or cell-fusion technologies. Most are designed to recruit cytotoxic eff ...

一、Bispecific antibodies introduction Bispecific antibodies usually do not occur in nature but are constructed by recombinant DNA or cell-fusion technologies. Most are designed to recruit cytotoxic eff ...

一、抗体的定义和第一代单克隆抗体（经杂交瘤细胞生产） 抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。70000之间，称为“重链”（H链）。轻、重链之间和两重链之间由二硫桥连接，这样的四链结构 ...

1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）。由于它应用核素标记抗体作为示踪剂，在反应体系中加入过量的抗体，待测抗原（或标准品）与和核素标记抗体进行全量反应，故亦称非竞争性免疫分析法。IRMA与RIA相比较有以下特点 1、IRMA反应系统中应用的标记物为免疫球蛋 ...

一、原理 在酸性条件下( pH4.5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。 二、材料与方法 1、材料 （1）动物腹水 （2）辛酸(caprylic acid CA)，化学纯 （3）硫酸钱，分析纯 （4）SPA Sepharose 4FF亲 ...

应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取IgG时，则往往采取下列的简易办法。 一、DEAE-纤维素直接提取法 取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。 1、以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲 ...

以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的7 ...

从小鼠腹水中纯化mcab的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用tsk deae-spw离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化mcab不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。 一、原理 根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含mcabγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。 二、试剂和器材 1、tsk deae spw离子交换层析柱 ...

一、原理 葡萄球菌a蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-sepHarose cl-4b 柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。 二、试剂器材 1、spa-sepharose cl-4b （pharmacia-sigma） 2、磷酸缓冲液0.1mol/l pH8.6＋0 ...

一、原理 deae-sephadex a-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶a-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被deae- sephadex a-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析， ...

1、 血清加3倍体积的蒸馏水，调节 pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀（a），含有大多数种类的免疫球蛋白。 2、 沉淀a悬浮于25倍体积的0.15～20mol/l NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/l醋酸调节 pH到5.1，产生的沉淀（b），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。 3 ...

精制抗体的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。 一、原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失 ...

免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步代表着B细胞的功能，因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。 随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分 ...

一、腹水 腹水重组后可加入少量叠氮纳等来阻止细菌生长。腹水应当冻存。单抗最好能够小包装保存以避免反复冻融。若要保存较长时间，则不要在4℃。和血清不同，腹水中含有蛋白酶，会使抗体效价下降，因此加入蛋白酶抑制剂可以选择。 二、纯IgG 不要稀释抗体后来保存，除非加入羊血清，BSA等后。IgG会和玻璃，塑料等粘附。当IgG的浓度小于0.1 mg/ml 会很快被吸收并变性，而失去活性。且反复冻融纯IgG肯 ...

一、免疫失败的可能原因及应采取的措施 有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。 1、免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。 2、抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。 3、制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并 ...

近年来单克隆抗体已广泛应用于基础理论与临床应用研究。如何制备质量好产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题，通常用于生产单克隆抗体的方法有两种 1、利用纯系小鼠生产免疫腹水，该法的优点是产量和效价高，但纯化困难，价格昂贵，生产周期长。 2、杂交瘤细胞常规体外培养法，此法虽然产量不高效价低，但不含正常小鼠免疫球蛋白，较易纯化且成本低，但此法若需大量生产则需特殊设备。最近有人报道用杂交瘤细胞 ...

在过去的二十五年里，利用杂交瘤细胞生产了成千上万的鼠单克隆抗体。人们用同样的技术从转基因鼠中克隆人类的抗体，并设计了全长型抗体和重组片段，它们可以被用于多种诊断和治疗。而且如果他们能在哺乳动物细胞，牛奶及植物中表达，就可以大量获得。 一个世纪以前，Paul Ehrlich提出了著名的侧链理论来解释抗原抗体的相互作用。他不久又铸造了一个虚构的短"魔弹"来形容抗体对准及中和抗原。七 ...

杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠B细胞和小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长（选择原理见后），小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 ...