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        单克隆抗体制备常见问题分析

        互联网

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        1. 免疫失败的可能原因及应采取的措施

        答:有时不能获得满意的抗血清,可从下列几方面找原因,并改进之。

        (1)免疫动物的种属及品系是否合适,可考虑改变动物的种属或品系,或扩大免疫动物的数量。

        (2)抗原质量是否良好,可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号,也可考虑改变抗原分子的部分结构,或改进提取方法。

        (3)制备的免疫原是否符合要求,可从偶联剂,载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑,并加以改进。

        (4)所用的佐剂是否合适,乳化是否完全,可改用其它佐剂,或加强乳化。

        (5)免疫的方法、剂量,加强免疫的间隔时间和次数,免疫的途径是否合适。

        (6)动物的饲养是否得当,如营养(饲料、饮水)、环境卫生(通风、采光、温度)是否符合要求,动物的健康情况是否良好等。

        2. 制备单克隆抗体影响因素、失败原因分析

        答:由于制备McAb的实验周期长,环节多,所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有:

        (1)污染

        包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之,以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清,此外,其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。

        在有条件的实验室,要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法,将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔,待长出腹水或实体瘤时,取出分离杂交瘤细胞,一般可除去支原体污染。

        (2)融合后杂交瘤不生长,在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素

        PEG有毒性或作用时间过长。

        牛血清的质量太差,用前没有进行严格的筛选。

        骨髓瘤细胞污染了支原体。

        HAT有问题,主要是A含量过高或HT含量不足。

        (3)杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

        融合后有细胞生长,但无抗体产生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变,变成A抵抗细胞所致。

        有可能是免疫原抗原性弱,免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性,可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”,可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

        三要:

        要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

        要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

        要定期进行再克隆。

        三不要:

        不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势,压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

        不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

        不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

        (4)杂交瘤细胞难以克隆化

        可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关,或由于细胞有支原体污染,使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化,应在培养液加HT

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