抗体抗原实验

常用HLA DNA分型技术的特点1、PCR-SSOPCR扩增的序列是具有多态性的HLA等位基因外显子，HLA-I类基因主要是第2和第3外显子，HLA-II类基因主要是第2外显子，PCR扩增产物用一组探针进行杂交，每一探针与相应型别的HLA等位基因序列互补。HLA等位基因特异性的探针可以检测已知序列的HLA等位基因。因此PCR-SSO是一种常用而精确的HLA基因分型方法，通常是将多个待测样本的PC ...

抗原特异性T细胞克隆的制备 （一）间歇循环刺激法 是制备抗原特异性T细胞克隆的传统方法，即经抗原间隔刺激多个循环。 【材料和试剂】 （1）抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3300rad照射的自身MNC （2）抗原 （3）含10％人AB型血清的完全RPMI 1640培养液 （4）细胞分离及T细胞培养增殖所需的其他试剂和器材。 【操作步骤 ...

常用HLA DNA分型技术的选用 HLA分型方法的选用首先取决于HLA分型的目的，组织配型中常用的是中等分辨率的分型技术，即分辨出与HLA抗原特异性相对应的HLA等位基因型别，而在某些研究中需要高分辨率的HLA分型，即需要分辨出HLA型别中的各种亚型。上述每一种DNA分型技术的分辨率都高、中、低的区别，在掌握各种分型方法的基本原理的前提下，通过改变SSO探针的组合，或限制性核酸内切酶的组合 ...

T细胞克隆技术 T细胞在机体特异性免疫应答中发挥举足轻重的作用，其特异性识别的靶分子与B细胞（或抗体）明显不同，不是抗原分子上的天然表位，而是由MHC分子提呈的抗原肽（T细胞表位）。由于T细胞识别的这种特点，决定了对其特异性的研究必须考虑抗原肽的性质和提呈抗原肽的MHC分子型别。 T细胞克隆的建立对于T细胞在免疫应答中的功能研究具有重要的意义。由于T细胞上TCR识别的抗原肽需要MH ...

抗原非特异性T细胞克隆的制备 【材料和试剂】 ①PBMC和经过照射的自身PBMC，照射的同种PBMC； ②5μg/ml PHA； ③50U /ml和25U/ml IL-2； ④T细胞分离、培养和计数所需的其他试剂和器材。 【操作步骤】 (1)从PBMC中分离T细胞，将1×105T细胞，5×104经过照射的自身PBMC，10μgPHA和50U IL ...

可溶性蛋白抗原特异性Th克隆的制备 与可溶性蛋白抗原反应的特异性Th克隆的制备需体内致敏，以及需要同系脾细胞作为抗原提呈细胞。有两种类型的辅助T细胞，即分泌IL-2的Th1和分泌IL-4的Th2，前者在克隆时需加入IFN-γ。 【材料和试剂】 （1）免疫用动物； （2）蛋白抗原和完全福氏佐剂（CFA）； （3）完全RPMI-1640培养液； （4）生长 ...

同种反应性Th和CTL克隆的制备 鼠T细胞克隆分为同种反应性T辅助细胞(Th)和细胞毒性T细胞(CTL)克隆，以及与可溶性蛋白抗原反应的Th1和Th2克隆。 同种反应性是指未免疫的鼠或人T细胞对同种异体细胞上组织相容性抗原的反应。尽管同种反应性T细胞克隆可从未免疫的脾细胞或淋巴细胞制备，但经同种抗原预刺激的细胞所获反应细胞的频率较高。细胞毒性和非细胞毒性T细胞可经有限稀释进行克隆 ...

HLA-I重链、轻链的制备（包涵体的制备）此步骤是用原核表达的方法制备HLA-I类分子的重链和轻链，其中重链为HLA-A2分子的α链（胞外段，包括α1至α3功能区），轻链为β2微球蛋白。HLA-A2分子的α链的C端连接有BSP（生物素结合部位），该部位是通过基因重组的方法将BSP序列与HLA-I类分子重链基因连接后，经过原核表达而获得。【试剂及配制】（1）LB培养基（2）0.4M IPTG（3 ...

HLA/抗原肽四聚体制备技术 MHC/抗原肽四聚体（tetramer）是借助亲和素-生物素结合的原理，在体外将MHC分子（MHC-I类分子包括β2微球蛋白）及其所提呈的抗原肽组装成的MHC-四聚复合物，作为TCR结合的配体，用于检测和分离特异性T细胞。图11-1是HLA-I/抗原肽四聚体结构示意图。图示由亲和素与四个生物素化的HLA-I类分子抗原肽复合物单体结合后形成的四聚体结构，其中亲和 ...

利用HLA/抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆 免疫反应的最显著特点是其特异性，是由于免疫分子与相应的抗原表位结合具有高度特异性。利用免疫反应的特异性，能够分离出抗原特异性的淋巴细胞克隆。B细胞上BCR（或抗体）能够直接识别抗原表位，利用某种抗原表位就可以鉴定和分离相应的B细胞克隆（或抗体），过程相对简单。与B细胞不同，T细胞上TCR识别的配体是抗原肽/MHC分子复合物，而不是 ...

四聚体的制备经上述过程制备的生物素化的MHC/抗原肽复合物为单体分子，通过加入链酶亲和素，一个链酶亲和素分子有4个生物素结合位点，即可以结合4个生物素化的MHC单体分子，形成MHC四聚体。

MHC-I单体的生物素化单体HLA-1类分子必须借助于其他分子的连接才能形成四聚体，一般借助生物素-亲和素将单体HLA-I类分子连接为四聚体，这种连接方式要求HLA-I分子重链C端或轻链上能够与生物素结合。此步骤是在BirA酶（生物素-蛋白连接酶）的作用下，将生物素结合到HLA-I类分子重链的BSP位点上。【试剂及材料】1、 试剂（1）100mM 生物素（Tris-base中）（2）10 ...

浓缩MHC-I单体折叠反应物上述折叠的HLA-I/抗原肽复合物存在于1L的折叠缓冲液中，需要进行浓缩，可以采用超滤进行浓缩。【试剂及设备】试剂与材料：20mM Tris(PH8.0) Biomax 30 membrane设备： 超滤装置（Amicon 500ml Stir Cell） 带有压力调节器的氮气瓶【操作步骤】（1）按照操作程序连 ...

MHC-I单体的S300 柱层析 在上述生物素化的样品中，折叠为单体的HLA-I类分子相当于样品中S300的组分。经过S300柱层析，可从样品中分离出折叠为单体的HLA-I类分子【试剂及材料】1、 材料（1）层析蠕动泵（Hiload Pump P-50，Pharmacia)（2）紫外监视仪（Monitor UV-1，Pharmacia)（3）部分收集器（RediFrac Fracti ...

MHC-I单体的Mono Q柱层析【试剂及材料】1、材料（1）快速蛋白液相色谱装置（FPLC）（2）层析柱（Mono Q HR5/5 Column）（3）离心过滤器（ultrafree-15，ultrafree-4） （4）50ml 聚丙烯离心管（5）IEC GP8R 离心机2、试剂（1）Buffer A ：20mM Tris(PH8.0)（2）Buffer B ：20mM Tris(PH8 ...

噬菌体展示技术基本原理 噬菌体展示技术（phage displayed technology，PDT）是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。1985年Smith，G.P提出将外源基因插入改建过的噬菌体外壳蛋白基因，表达含有外源蛋白或多肽的融合蛋白，这种带有融合蛋白的噬菌体称为融合噬菌体。通过吸附- ...

噬菌体展示抗体库构建的载体 抗体库技术是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体 单链抗体（ScFv）是一种基因工程抗体，能够在原核宿主中表达，不论是在性能方面，还是在制备方面，均具有独特的优越性。关于基因工程抗体的特点与制备过程，见本书第一章的有关内容。这里仅介绍噬菌体展示技术在制备单链抗体中的应 ...

小鼠单链抗体表达库所设计的VH和VL引物VH FR1引物VL FR1引物15’-GGCTCGAGCAGGTT(G)CAGCTGC(A)AGCAGTCT(A)GG5’-CCTCTAGAGACATCCAGATGAC(A)CCAGTCTCC25’-GCTCGAGCAGGTG(A)CAGCTGG(A)T(A)GC(G)AGTCT(A)GG5’-CCTCTAGAGACATT(C)G(T)TGCTGACC ...

抗体库的构建 【材料和试剂】 （1）电转仪（2）电击杯（3）SB培养基（4）SOC培养基SB培养基经高压灭菌后，降温至60℃或60℃以下，加入20ml经过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液。50mg/ml氨苄青霉素水溶液，过滤除菌。10mg/ml 卡那霉素水溶液，过滤除菌。4% PEG溶液 【操作步骤】 （1）将第4步得到的连接物与300μl感受态细菌混匀旋转1min转 ...

PCR产物的酶切 经过电泳回收的PCR产物直接酶切的效果往往不佳。这主要是因为酶切位点太靠近片段两侧缺乏足够多的保护碱基。要克服这一问题要么在最初引物设计时加上较多的保护碱基要么用过量的限制内切酶长时间消化。而后者的效果并非特别理想。我们尝试首先将PCR产物互相平连再以过量限制性内切酶长时间消化得到了较好的效果。这种方案的潜在危险在于当酶切仍不完全时最后得到的片段两端很可能带有同一种酶的识 ...