免疫学技术

组织切片的免疫酶标抗体染色法 1)4％多聚甲醛固定的组织置15％～20％蔗糖PBS中漂洗，4℃过夜或组织块下沉至 杯底； 2)制作30～40um厚的振动切片或冰冻切片，PBS漂洗； 3)2％H2O2甲醇处理，室温20分钟，封闭内源性过氧化物酶活性； 4)1％BSA室温孵育15分钟； 5)第一抗体4℃孵育12～24小时，PBS漂洗； 6)HRP或生物素标记的第 ...

免疫纳米金电镜技术基本原理 在免疫酶电镜技术中，由于过氧化物酶催化H2O2与DAB的反应产物多呈弥散分布，常使被检抗原在组织或细胞内的超微结构定位模糊不清。而胶体金免疫电镜术所用的胶体金对许多蛋白质均具有较强的亲和力，尽管研究者们尝试了用BSA等其他蛋白质包被暴露的金颗粒表面，以确保金颗粒与IgG或Fab片段之间l：l连接，但由此也导致标记探针过大，加之常用的胶体金颗粒为5～20nm，本身 ...

免疫胶体金电镜染色方法 免疫胶体金电镜染色亦可分包埋前和包埋后两种染色方法，前者因标记抗体对细胞膜的穿透性较差，故仅适于细胞表面抗原的显示，而后者较常用于对细胞内抗原的显示。现分别介绍如下： (1)包埋后染色 1)常规包埋或低温包埋的组织标本按包埋后染色要求制作50一70nm超薄切片，切片载于镍网或金网上； 2)经(OsO4后固定或环氧树脂包埋的组织，需用H2O2蚀刻。 ...

胶体金标抗体双重染色法 利用两种不同直径的胶体金颗粒标记两种第二抗体，在电镜下进行两种不同抗原的亚细胞定位。基本原则：首先需购买拟研究的两种抗原的特异性抗体，以及不同直径金颗粒标记的相应第二抗体，然后在同一张载网上分别或同时显示组织细胞内两种抗原所在部位。染色方法主要为包埋后染色，操作步骤与显示单一抗原的包埋后染色程序基本相同，在第一种抗体染色后，再重复上述染色过程，显示另外一种抗原成分。 ...

电镜免疫胶体金―银法染色技术 免疫胶体金―银染色(1mmunogold-sliverstaining)技术系20世纪80年代Holgate将免疫金染色和银显影方法结合而建立的一种新型检测技术，亦可用于电镜包埋前染色。其基本原理是先进行免疫胶体金染色标记抗原，使其结合在组织细胞抗原所在位置，然后进行物理显影，当显影剂中的对苯二酚将银离子还原成银原子时，后者将围绕金颗粒形成一个“银壳”。“银壳 ...

显微图像分析系统组成 在形态学研究中，一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量检测信息。如在组织化学和免疫组织化学技术中，制作了理想的标本，如何进行观察才能客观地获得尽可能多的定量信息，这是学习显微图像分析术的目的。目前，组织化学和免疫组织化学只能解决某一物质存在于何处，而不能精确地确定此物质量的多少，所谓“量”包括颜色深淡、其所占的长度或面积等，借助于显微图像分析系统(micro ...

免疫纳米金电镜技术银加强液漂洗缓冲液定影液配置 A液(HEPES贮存液)：称取23．83gHEPES溶于80ml双蒸水，用1mol/L NaOH调至pH 6．8(不能用HCl)，用双蒸水补充至终体积100ml即为lmol／lHEPES贮存液。4℃保存。 B液(阿拉伯胶)：称取50g阿拉伯胶粉(gum arabic)加入250ml烧杯中，加100ml双蒸水，室温下搅拌l～2天，用4层 ...

组织化学与免疫组织化学定量分析技术 组织化学和免疫组织化学只能对组织细胞内的化学成分或抗原进行定性和定位观察：随着现代物理学的飞速发展，新理论和新技术不断涌现，发明出一批可进行定量分析的仪器，最常应用的有图像分析仪、流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜及体视学技术等，它们是现代形态学研究不可缺少的工具，它们的出现使形态学研究从定性和定位水平上升到定量分析水平。 显微图像分析系统的特点是 ...

免疫纳米金与免疫酶结合的双重染色 按以下步骤进行免疫染色： 1)含1％正常血清或l％BSA的PBS预孵育20～30分钟； 2)两种特异性第一抗体(免疫自不同种属动物)的混合物4℃下孵育24～48小时；PBS漂洗3次，每次10分钟； 3)与第一抗体种属相应的纳米金标记的IgGFab，片段和生物素标记的第二抗体的混合物室温孵育2小时或4℃下孵育12小时后PBS漂洗3次，每次1 ...

包埋前免疫纳米金单重染色 免疫纳米金染色与免疫胶体金―银法染色基本相似，也可分为包埋前染色和包埋后染色。下面分别介绍包埋前免疫纳米金单重染色和与免疫酶染色结合的双重染色基本程序： 包埋前免疫纳米金单重染色按以下步骤进行免疫染色： 1)含1％正常血清或l％BSA的PBS预孵育20～30分钟； 2)特异性第一抗体4℃孵育24～48小时后PBS漂洗3次，每次10分钟； 3 ...

基本术语和常用测量参数（一）像素与灰度 1．像素 是构成显示器图像的最基本单元，按行和列(X和Y)方向排列成矩列。任何一矩列均对应一个点，这些点称为像素。单位面积屏幕上像素愈多则图像愈清晰，即分辨率愈高，显示的图像也越细腻和真实。数字图像的像素越多，灰度量化等级也越多，图像分析仪分析出的结果越准确。但是。当像素达到一定量时，由于图像分析仪计算机的存储量和计算量呈几何级数增大，从而减慢了计 ...

免疫荧光标记样品 用于流式细胞仪检测的常用荧光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5，PE和PI，在以上各种荧光染料中，PE荧光最强，适用于弱表达抗原；FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广。 1．直接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(浓度约l×l06个／m1)，直接加入荧光素标记抗体进行免疫反应(如做双重标记或多重标记染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)。4 ...

显微图像分析处理程序 使用显微图像分析系统处理显微图像时，使用者实际操作很少，几乎完全是通过鼠标来操纵复杂的运行过程，计算机软件可按实际需要行使其功能。计算机屏幕上显示多项指令，由鼠标指明你所需要的程序即可。虽然不同品牌和不同型号的显微图像分析系统的具体性能参数不同，但在使用中基本处理过程相同．区别只在于对显微图像的不同采集参数和处理软件的设定和使用上。显微图像处理的基本过程包括制作切片样 ...

吸光和发光组织样品的常用测量参数 像素是显微图像分析系统的最小测量单位，通过它我们不仅能够得到待测范围内的几何形态信息，如面积、周长和直径等等，还可根据样品是否能够吸光或发光来测量其物质的总含量。在组织化学和免疫组织化学中常用荧光素来标记物质，使被测量物质产生有色荧光，从而进行分析。此外，在原位杂交技术中，采用放射自显影的标本也可以作为发光组织细胞样品使用显微图像分析系统进行分析。 ...

流式细胞术的常用样品制备方法 流式细胞术的实验检测对象是单细胞悬液，因此，在组织化学和免疫组织化学实验中欲对待测样品细胞进行分类计数，也需把样品制备成细胞悬液，并要求被检细胞大小为0．2～80pm，每个样品中至少有20 000个细胞，细胞浓度为105～107个／ml。制备成的单细胞悬液经荧光或免疫荧光标记即可上机检测。 1．单层培养细胞单细胞悬液的制备 (1)弃去培养细胞(对 ...

流式细胞术在组织化学与免疫组织化学中的应用 流式细胞术(flow cytometry，FCM)是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。该技术是一项集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学、免疫荧光细胞化学技术及单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。概括地说，流式细胞技术是通过流式细胞仪(flowcytometer)对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速 ...

流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机和分析系统。四大系统共同完成信号的产生、转换和传输任务。检测时将待测细胞或微粒制成细胞悬液，进行荧光染色后加入样品管中。以一定压力将待测样品压人流动室，在高压下磷酸缓冲液(鞘液)从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形流束 ...

运用流式细胞仪计数细胞应注意的问题 制作组织匀浆或细胞悬液，用荧光染料染色，则可以用流式细胞仪计数不同DNA含量或倍数的细胞数。例如，在睾丸组织中，精子细胞为单倍体细胞，精原细胞、Sertoli细胞、Leydig细胞和其他非生精细胞为双倍体细胞，初级精母细胞以及处于分裂期的精原细胞和非生精细胞为四倍体细胞。因此，运用流式细胞仪测定睾丸组织各级生精细胞DNA倍体的变化，可以间接判断不同生精细 ...

流式细胞术数据处理与分析 数据的显示通常可分为一维单参数直方图(histogram plot)、二维点图(dot plot)、二维等高图(contour)和假三维图(pseudo 3D)等。下面简述最常用的单参数直方图和二维点图。 1．单参数直方图 单参数直方图是一维数据用得最多的图形，可用来进行定性分析和定量分析。横坐标表示荧光信号或散射光信号强度的相对值，其单位用“道数”(c ...

激光扫描共聚焦显微镜在组织化学和免疫组织化学中的应用 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confcal microscopeLSCM)是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段相互渗透的产物。由于其高分辨率，高灵敏度及高放大率等特点，在细胞水平上能作多种功能测量和分析，如荧光定量测量、共聚焦图像分析、三维图像重建、活细胞动力学参数监测和细胞间通讯研究等，成为生物医学 ...