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        免疫胶体金电镜染色方法

        互联网

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        免疫胶体金电镜染色亦可分包埋前和包埋后两种染色方法,前者因标记抗体对细胞膜的穿透性较差,故仅适于细胞表面抗原的显示,而后者较常用于对细胞内抗原的显示。现分别介绍如下:

        一、包埋后染色

        1. 常规包埋或低温包埋的组织标本按包埋后染色要求制作50一70nm超薄切片,切片载于镍网或金网上;

        2. 经OsO4 后固定或环氧树脂包埋的组织,需用H2O2 蚀刻。以增加抗体的通透性。方法:将1%H2O2 (数滴)滴于蜡板上。镍网的载切片面向下轻轻浮于液滴表面或置于液滴内,室温10分钟,低温包埋剂包埋的组织细胞可省略此步骤。

        3. PBS漂洗3次,每次5~10分钟;

        4. 正常羊血清(1:50)或1%BSA室温孵育20~30分钟;

        5. 第一抗体孵育,可先置4℃,12~24小时,然后室温1小时,使抗体充分渗透并结合。

        6. PBS漂洗同上;

        7. 将载网置含1%BSA的PBS(pH 8.2)中,为胶体金标抗体的结合提供碱性环境:

        8. 胶体金标记的第二抗体(1:50,以pH 8.2的PBS稀释)。室温孵育20―30分钟;

        9. 双蒸水洗3次,每次5分钟

        如进行双标记免疫染色,则用PBS漂洗,重复步骤③一⑦;

        10. 直接或经电子染色后进行电镜观察,方法与常规电镜操作相同。

        二、包埋前染色

        1. 将冰冻组织切片贴于涂抹黏附剂的载玻片上。培养细胞经离心后可制成涂片,冰冻组织切片也可进行漂浮染色。

        2. PBS漂洗及染色程序与包埋后染色步骤基本相同。第一抗体的孵育时间可适当延长,一般先置4℃,24―48小时,再室温孵育1~3小时。染色后,最好用1%OsO4 后固定30~60分钟,以提高固定效果,增强电子密度。然后按照常规电镜标本制作方法进行系列乙醇或丙酮脱水、包埋、超薄切片及电子染色等处理。

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