免疫学技术

微小RNA与表现遗传 微小RNA(microRNA，miRNA)是生物体内一类非编码的RNA分子，其长度大约为22个碱基，调控基因的表达。1993年，Ambros在线虫中发现第一个miRNA分子lin―4以后，一直没有任何进展，直到2000年，Ruvkun发现子第二个miRNA分子1et―7，才引起了轰动。现在，miRNA已经成为国际学术界炙手可热的研究对象。研究发现，miRNA与发育、造 ...

孕激素受体(PR) PR基因定位于染色体1lql3，其基因第一个外显子区有一CpG岛。PR基因编码两个异构体：hPRA和hPRB，它们的N端序列与生物活性不同。与配体结合的雌激素受体是hPRB转录必需因子，hPRB表达说明功能性ER存在。用DNA印迹法分析表明，约40％的PR阴性乳腺癌组织和PR阳性的肿瘤细胞系都发现PR基因甲基化。在雌激素存在的条件下，用5―氮杂―2―脱氧胞苷处理PR阴； ...

雌激素受体a(ERa) 甾体类激素特别是雌激素，长期以来都被认为与乳腺肿瘤发生有关。雌激素及其儿茶酚类代谢产物在乳腺癌启动和演进过程中的作用，是人们长期的研究热点。17p雌二醇可通过有功能的ER刺激乳腺癌生长，这是乳腺癌内分泌治疗的理论依据。乳腺癌细胞表面的雌激素受体是激素疗法起作用的重要标志。近1／3的乳腺癌在确诊时为ER阴性，还有一部分乳腺癌在演进过程中逐渐变为ER阴性。迄今为止，未发 ...

DNA甲基化与组蛋白乙酰化的协同在肿啼发生中的作用 DNA甲基化与组蛋白去乙酰化在肿瘤抑制基因的沉默方面具有协同效应。DNA甲基化引起基因转录抑制的可能机制主要有：①DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。②甲基化胞嘧啶结合蛋白(MeCPl、MeCP2和MBD)与启动子区甲基化CpG岛结合，然后募集蛋白形成转录抑制复合物，从而阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，影 ...

与基因稳定性有关的基因 与基因稳定性有关的基因主要是乳腺癌易感基因―1(BRCA―1)，它位于17q21，是熟知的乳腺癌易感基因。用反义核酸技术抑制BRCAl的表达，可增加正常及恶性乳腺细胞的增殖，而野生型BRCAl的过度表达可抑制MCF―7等乳腺癌细胞在小鼠体内的成瘤能力。在近一半的遗传性乳腺肿瘤中发现BRCAl的遗传性突变。与其他抑癌基因不同的是，尽管在乳腺癌及卵巢癌中BRCAl基因发 ...

寡核苷酸微阵列法 该方法以已知CpG岛的序列分别设计能够与甲基化和非甲基化CpG岛片段杂交的寡核苷酸探针微阵列，用于同时分析众多已知CpG位点的甲基化状态。样品基本处理步骤如下：DNA经MssI(酶切位点是GTTT)消化后用亚硫酸氢钠处理，再在酶切位点的粘性末端加上接头，用通用引物进行PCR扩增、荧光素标记、微阵列杂交及扫描。该方法的优点是能直接得到目标CpG岛的甲基化信息。缺点是有这种合 ...

与肿瘤侵袭转移有关的基因 侵袭性是恶性肿瘤的重要特征。肿瘤的侵袭、转移包括细胞黏附能力下降、穿破基底膜进入血液循环、逃避免疫监视及在远隔部位生长。目前，已发现3种参与乳腺癌侵袭转移的基因发生异常甲基化。 1．钙粘连蛋白(cadherin)钙粘连蛋白在抑制肿瘤侵袭、转移中起重要作用。E―钙粘连蛋白定位于16q22，编码细胞表面的黏附分子。E―钙粘连蛋白的表达下降在分化差、分级高的肿瘤 ...

组蛋白乙酰化在肿瘤发生中的作用 组蛋白乙酰化状态取决于组蛋白乙酰基转移酶(HAT)与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)之间的活性竞争。HDAC异常结合到特定的启动子区，从而抑制正常功能基因的转录，可能是恶性肿瘤发生的机制之一。HDAC抑制剂在肿瘤治疗中具有一定作用，这也说明组蛋白的乙酰化与肿瘤之间存在一定关系。很多研究已经表明，癌基因和抑癌基因的异常表达与肿瘤的发生有关。 肿瘤发生时，组 ...

miRNA与肿瘤 miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用，它们在正常组织和肿瘤组织中的表达显著不同，因此可以认为它们参与了肿瘤的发生、发展和预后。近期的研究发现，一些miRNA在肿瘤细胞中表达明显减少，提示着这些分子可能作为抑癌分子，如MiR―127可以诱导癌基因BCL6的下调。有些研究还显示，MIR的表达也受DNA甲基化和组蛋白修饰调节。这为肿瘤的治疗提示了一个新方向。 ...

DNA甲基化的研究方法 DNA甲基化的分析方法很多，可分为总基因组甲基化的检测和单基因序列特异性甲基化分析的研究。总基因组甲基化的检测又分为全基因组序列特异性甲基化分析和基因组非特异性甲基化水平的研究。前者包括甲基化差异性杂交显示(differential methylation hybridization，DMH)、寡核苷酸微阵列法和基因组限制性酶切扫描法(restriction lan ...

基因组限制性酶切扫描法(restriction landmark genome scanning，RLGS) 该方法是将基因组DNA放射性标记，首次电泳后原位消化，二维电泳成约2 000个离散片段。这些片段几乎包含了整个基因组序列，并且片段大小适合克隆和序列分析。RLGS能在凝胶中定量分析数千个CpG岛的结构和甲基化变化，而无需已知基因序列。 1)RLGS的基本步骤 (1)首 ...

限制性酶及PCR的方法 此法将MSRE和PCR技术的结合，大大提高了检测DNA甲基化的灵敏度。该法基于DNA经MSRE切割后，位于限制性位点侧翼的特异性引物仅能有效扩增那些甲基化而免于切割的DNA片段，但不能扩增未甲基化且遭受切割的DNA片段。本法定性只需0．6ngDNA，定量检测仅需50ngDNA，检出下限(指某一方法能检测到甲基化等位基因的拷贝数在整个DNA分子中所占的最小比例)约降低 ...

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing) 直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列 ...

结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析(COBRA) 亚硫酸氢钠处理的DNA扩增后使甲基化的胞嘧啶残基成为胸腺嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶残基仍维持胞嘧啶。这种变化会产生新的酶切位点或保持原有的甲基化依赖位点。PCR反应的引物中不包含CpG二核苷酸，因此与模板和原来的甲基化位点不会混淆。在此之后，将PCR产物纯化、酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳、电印迹、单核苷酸杂交和磷图像定量。 COBRA是一个测 ...

DNA甲基化抑制剂和HDAC在肿瘤治疗中的应用 目前发现一些胞嘧啶类似物可以抑制DNMT活性，例如5―氮杂胞嘧啶核苷和它的脱氧类似物5―氮杂―2―脱氧胞嘧啶核苷，它们可以有效地抑制DNA甲基转移酶。通过在DNA复制过程中取代胞嘧啶及与DNMT，形成共价键后抑制DNMT的活性及抑制DNA甲基化，被广泛应用于研究DNA甲基化的生物过程和治疗急性粒细胞白血病。但这两种药物在水溶液中不稳定，且有毒 ...

细胞信号转导的概念 生物体是有一群具有特殊结构与功能的细胞组成的复杂有机体，生物物种的繁衍，遗传特性的保持，以及生物个体的发生、发展，机体各部分之间和生物体内外环境的统一等所有生命活动，都是在细胞信息传递和调控下进行的。因此多细胞生物对外界的刺激(包括物理、化学、生物因素)，需要细胞间复杂的信号转导系统来传递，从而调控机体内每个功能各异细胞的新陈代谢和行为，以保证整个生命活动的正常进行。细 ...

甲基化荧光PCR检测 甲基化荧光检测(methylight)是利用荧光定量性PCR检测亚硫酸氢钠处理后的序列改变。在TaqManR技术中，可以使用3种不同的单核苷酸(正义引物、反义引物和荧光杂交探针)，进行不同序列的检测。与已存在的技术相比，甲基化荧光检测最明显的优点就是能同时对几百甚至几千例样品迅速检测。 高敏感、快速是本方法最显著的特点，它可以在非甲基化等位基因超出10 ...

酶的区域性甲基化特异性分析(ERMA) 酶的区域性甲基化分析是一种定量区域性CpG甲基化密度研究方法。基因组DNA在亚硫酸氢钠处理后，感兴趣的区域由包含dam位点的引物扩增。扩增后的PCR产物与14C标记的SAM及dam甲基转移酶温育，作为标准DNA定量的内参照。之后将3H标记的SAM和M．SssI甲基转移酶温育。在每个检测中使用具有确定甲基化位点细胞系DNA的标准混合物，每个样品的3H／ ...

组蛋白乙酰化的研究方法 1．HAT活性的测定 HAT可以催化放射性标记的乙酰辅酶A掺人核心组蛋白(有的选用H4氨基末端的14个氨基酸短肽)底物，然后测定掺人的放射性强度可以确定HAT的活性。HAT的活性单位定义为30~C时，将1pmol醋酸在10rain内掺人小牛胸腺组蛋白所需的酶量。 2．HDAC活性的分析 HDAC活性的检测比较烦琐。 3．染色质免疫沉淀技术 ...

甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms―SnuPE) Ms―SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms―SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms― ...