亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)

直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。

重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。

最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。

测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，所以能够同时扩增出甲基化 和非甲基化靶序列。它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。