免疫学技术

原位PCR的反转录 原位PCR的反转录不同于原位PCR的过程包括两个：即蛋白酶消化后用无RNA酶的DNA酶消化过夜和原位PCR的反转录过程。此处主要介绍这两个过程，其余方法同原位PCR。1．DNA酶消化【试剂与配制】无RNA酶的DNA酶10×缓冲液：35μl 3mol/L NaAc，5μl 1mol/L MgSO4，60μl DEPC水【操作方法】（1）在蛋白酶处理过的玻片上加入1μl ...

竞争PCR作mRNA定量 此种技术的策略是用一种竞争模板与靶序列cDNA同时扩增，使用同样的引物经过PCR扩增之后，能将这些靶cDNA区别开来。竞争模板是一种突变的靶cDNA，它的突变位点为一个新的限制性内切酶位点，这种突变体能够很容易地用PCR定点诱变来得到。也有利用基因组质粒DNA作为竞争模板，在紧靠一小段(10～200bp)内含子序列的两个外显子上选择寡核苷酸引物，按照靶cD ...

不同浓度竟争模板和控制混合液的配制────────────────EP管号 竟争模板gGM浓度 用量(ng/μl)────────────────1 10.0 10μl2 1.0 10μl3 0.8 10μl4

应用PCR扩增T细胞受体基因重排【操作方法】 （1） 引物设计：引物1～11是用于PCR的引物其目的是扩增目的基因和分离特异性探针分别适用于Vδ1-D1-Jδ1重排和Vδ2-Dδ3重排的检测。见表。引物4中用G#取代野生型A产生限制性内切酶Fok1位点。 表 扩增TCR基因重排PCR引物────────────────(1) 5’-GTGTGTATTTGTGGCCTTCA-3’(2 ...

用PCR检测白血病时T细胞受体β链基因重排【操作方法】 （1） 引物设计：已知基因重排分二步进行其结果为：①D/J重排:Dβ1和Jβ6 Jβ7之间重排产生D―N―J融合片段N为随机寡核苷酸；②V/D重排:Vβ和Dβ1―N―Jβ6―Jβ7之间再重排，产生V―N’―D―N―J重排片段。对于D/J重排引物设计于Dβ1和Jβ2互补片段，对于V/D重排则设计一条与Vβ片段互补，另一条与Jβ2片段互 ...

间接原位PCR（原位杂交PCR）与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。1．预杂交【试剂与配制】2×SSC50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉【操作方法】（1）在进行完原位P ...

PCR在淋巴细胞抗原受体研究中的应用 T细胞识别各种抗原，是依靠细胞表面的T细胞受体复合物(TCR)。TCR是由4条多肽链(α.β.γ.δ)组成，每条链由相应的基因编码，其基因是由高变区(V)，多样区(D)，连接区(J)和恒定区(C)组成。由于不同的V―D―J重排，使PCR产生多样性和特异性。经PCR扩增可以检测细胞单克隆基因重排，同样，免疫球蛋白(Ig)重链基因重排是产生抗体多样性和特 ...

PCR扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因 在B细胞发育过程中V―D―J的重排可导致某些核苷酸的随机缺失或插入。因此不同的B细胞克隆经PCR后产生的扩增片段长短不一。正常的多克隆淋巴细胞群的扩增片段含有不同长度的片段电泳检查时呈现出所谓的“片状”结构而单克隆的B淋巴细胞白血病标本经PCR扩增后产生一明显的同一长度的扩增片段电泳时呈现出紧密折带状结构。这就是应用PCR快速检测单克隆性的残留白 ...

应用锚定PCR技术对TCRδ链进行分析【操作方法】（1） 提取外周血淋巴细胞总RNA；（2） 利用oligo-dT或特异的C区序列作引物在逆转录酶作用下合成第一条cDNA链；（3） 于cDNA 3’末端添加Poly(dG)尾反应液(含2mmol/L CoCl21 mmol/L dGTP)和脱氧核酸末端转移酶(TdT)，37℃×1h;70℃终止反应，用乙醇沉淀DNA；（4） PCR扩增：基因5’端 ...

基于细胞表面标记的免疫细胞分离方法1、补体细胞毒分离法 采用特异性抗细胞表面标记的抗体，结合具有该表面标记的细胞，在补体的作用下，使具有该表面标记的细胞发生溶解，将其从混合细胞群体中去除。2、免疫磁珠分离法磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用， ...

基于细胞物理性状的免疫细胞分离方法1、根据各种细胞比重的差异（1）自然沉降法（2）密度梯度离心法 ①Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cellPBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为1.075左右。利用 ...

外周血白细胞的分离1．自然沉降法　 人外周血红细胞与白细胞的比例约为6000～1000:1，两类细胞的沉降速度不同，据此加以分离。自然沉降法是利用红细胞自然沉降率较快加以分离。该法简便易行，对细胞损伤少，但纯度差。【试剂及配制】（1） 无Ca2+、Mg2+ Hank’s液（2） 含10%～20% 灭活小牛血清Hank’s液【操作方法】（1） 取静脉血2ml，放入加 ...

免疫细胞的分离 免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其它抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。 各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定籍以了解机体的免疫状态并 ...

白细胞的纯化1．低渗处理法【试剂及配制】（1）蒸馏水（2）1.8%氯化钠溶液【操作方法】（1） 上述各种方法所得白细胞悬液中加入1ml蒸馏水，轻轻地震荡20s，使混杂的红细胞裂解；（2） 加等量1.8%氯化钠溶液，调至等渗；（3） 再加Hank’s溶液混匀，离心沉淀，反复两次;（4） 取末次沉降细胞配成所需浓度的白细胞悬液。2.氯化铵处理法【试剂及配制】（1） ...

淋巴细胞的分离单核细胞和多核白细胞具有粘附在塑料或玻璃表面及吞噬羟基铁粉等特性，而淋巴细胞则不能，由此可将其从悬液中分离出来。（一）玻璃器皿吸附法【操作方法】（1） 将分离的外周血单个核细胞（PBMC）悬液（2×106 /ml）倾入 玻璃平皿中，于37℃温箱静置30～40min使单核细胞粘附与玻璃平皿上； ...

聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.077±0.0001。（2） 台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min 离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。（3） HBSS或RPM ...

聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液分离法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1） 1.5mol/L 10×PBS：称取10g NaCl，2.5g KCl，14.4g Na2HPO4，2.5g KH2PO4， 先用少量蒸馏水溶解上述各物，再用蒸馏水定溶至1000ml。 （1） 1×PBS：将上述10×PBS用蒸馏水稀释10倍即成。（2） ...

抗体/补体介导的特异性细胞毒作用分离法分离T细胞亚群人T淋巴细胞按其表面标志分为CD4+T和CD8+T细胞两类，其细胞膜上分别有CD4和CD8分子，当它们与相应的鼠抗人单克隆抗体结合后，在补体的参与下，可溶解相应的T细胞亚群，从而分离出另一种细胞亚群。【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）。（2） Hank’s液（内含5%小牛血清和1.0g/ ...

E花结形成分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞为了深入研究T、B细胞的生物学特性和功能，必需从淋巴细胞群体中分离出单一的T细胞或B细胞，以满足实验要求。根据T、B细胞膜表面标志及粘附能力等特性的不同，可将两者加以分离，常用的方法有E花结形成法、免疫吸附法和免疫磁性微珠分离法，近年来应用流式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或亚群。（一）此法是基于成熟的T细胞表面有独特的绵羊红细胞(SRBC)受体 ...

盘选(Panning)分离法分离T细胞亚群 聚苯乙烯表面可以用作亲和性试剂的不溶性基质以分离淋巴细胞亚群.聚苯乙烯培养皿首先用纯化的羊抗鼠IgG抗体包被然后将鼠抗人(如抗CD4或抗CD8单抗)与T细胞反应的细胞悬液加入培养皿中孵育一段时间后对CD4或CD8抗原特异的T细胞即结合到平皿表面而CD8+或CD4+细胞不结合轻吸出未贴壁的细胞悬液洗下粘附细胞。【试剂及配制】（1） 聚蔗糖- ...