细胞技术

问：我现在在养细胞，然后收细胞抽蛋白以及提RNA用，我想先多收点细胞冻着。想问一下怎样收集细胞，有具体的流程吗？ 我是这样做的： 1、将细胞消化吹打后转移至离心管离心 2、倒去上清，加1 mlPBS打匀后转移至1.5 ml EP管 3、离心12000 rpm 2 min （不知道大家这里用多少转速，有讲究吗？） 4、倒去上清，我是将EP管倒置一会，但是EP管里面还是有一些上清，我没有倒干净，请问是 ...

DXY网友mao_xianwang提问：最近测酶活性，但觉问题一大堆！ 1、接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？ 2、给细胞染毒时我听说有两种方案，比如说染三天毒 （1）先接种20%-30%，三天之后收获时刚好长满 （2）一开始就接种70%-80%，然后以3%或者5%血清，这样尽量不让细胞分裂增值，三天之后收获试问，哪个更可行呢？ 3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子 ...

DXY网友mavisw提问：我用六孔板做细胞转染，转后要做western blot检测，今天裂解转染后的细胞时直接往六孔板的每个孔中加入了400微升的细胞裂解液，收集离心后未见沉淀，不知道用裂解产物做western blot蛋白含量够不够？DXY网友Pureflat回复：六孔板中加入400微升裂解液太多，这样会使你得到的蛋白浓度过低，满足不了Western blot上样的需要，我第一次做这个实验时 ...

DXY网友sunyuxiaoxi提问：细胞状态很好，想尽快做western blot。但是存在以下问题：我要在培养的细胞中注射一种药物，观察此药物作用不同时间下我要检测的指标的变化。我取的时间点是：注射药物后10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h。能否待我把各时间点的细胞都收集好了，再统一加细胞裂解液，然后测蛋白？ 但我所在实验室的有些同学说：不可以，必须是收集完细胞后马上加裂 ...

DXY网友molihua505提问：这两天做的western，细胞用过氧化氢处理后再提的蛋白。过氧化氢引起细胞损伤，有一些死细胞，我又把培养基中的死细胞离心取沉淀了。 发现浓度较大的组，目的蛋白减少和对照组相比变化不怎么明显，而相对应的actin（肌动蛋白）却比对照少了许多，想问过氧化氢能使actin减少吗，导致过氧化氢处理后内参不应该再用actin了？这是怎么回事啊？ DXY网友yangea回复 ...

问：用800g - 8600g 分离线粒体后，得到浅褐色-褐色物质，哪一种组分才是真正的线粒体啊？ 答：褐色物质就是线粒体，用JANUS GREEN B染色就可验证。 ...

DXY网友yfq1232000提问： 今天做了一个小抽，但跑电泳时却没有条带，我抽过多次质粒，应该不会抽不出来，我考虑是不是菌液里没有我要的菌，是杂菌，但是我的LB里放了amp+，如果有杂菌的话那么也抗amp+，而一般的抗性基因都位于质粒上，而试剂盒又不仅仅是只能抽DH-5a的质粒，那么也是应该可以抽出杂菌的质粒，这样的话也是应该有条带的啊？这是为什么? DXY网友heartips回复： 1、小 ...

1、第一种方法 试剂： 变性液组成：25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB中（42 mmol/L pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mmol/L β-巯基乙醇），65 ℃溶解，过滤灭菌，4 ℃预冷。 酸性酚配制：55 ℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mmol/L，pH4. ...

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问：BAF cell的来源是什么？有什么特性和用途呢？ 答：ATCC上没有你所谓的BAF cell，DSMZ上有两种BAF cell，如下： Cell line:BA-F8 Cell type:mouse hybridoma(anti-rat fiber/myosin) Origin:this hybridoma cell line was described to secrete a mouse ...

问：我打算检测线粒体膜电位，大鼠肺移植后，如何分离肺泡上皮细胞呢？ 答：步骤如下： 1、取得完全无血液残留的肺脏： 实验前将大鼠全身血液放净，取得完全无血液残留的肺脏。 2、消化肺组织： 常用于细胞消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮细胞的酶，现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定，有效作用时间短暂，容易自我降解等问题。Dobbs ...

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃ ...