细胞技术

细胞因子的生物活性检测法 不同的细胞因子有其特有的生物学活性。细胞因子的生物活性检测法是利用细胞因子对特定细胞株（靶细胞或反应细胞）的生物学效应来评估样本中相应细胞因子的含量和/或活性。生物活性检测法所用的靶细胞可直接从组织中分离，如骨髓细胞的集落形成试验和胸腺细胞(脾细胞)的增殖试验，或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为靶细胞其测定方法可分为促 ...

PI染色法（活细胞染色）检测细胞凋亡【染料及试剂】（1） 含0.1%TritonX-100的PBS缓冲液（pH7.4）（2） PI染液:将PI（碘化丙啶）溶于含0.1%TritionX-100的PBS中，终浓度为50μg/ml，含RNase 100μg/ml，避光保存。（3） 荧光显微镜【操作方法】制备凋亡细胞悬液，浓度为106/ml；取1ml的 ...

DAPI染色法检测细胞凋亡【材料与试剂】含0.1%Triton X-100的PBS缓冲液；DAPI染料（4，6-diamidino-z-phenylindole）100μg，溶于100ml含0.1%TritionX-100的PBS缓冲液中，避光保存。【操作方法】将制备好的石蜡切片按常规脱蜡、水化（按HE染色的脱蜡方法），用PBS洗5min；或冰冻切片用冰丙酮固定15min，吹干，用PBS洗５m ...

电子显微镜检测法检测细胞凋亡 具有凋亡特征的细胞程序性死亡后，可在扫描或透射电镜下观察到“凋亡小体”，该小体系由细胞膜卷曲、脱落形成的小泡，其内包含有完整的细胞器及核片段。这种小体易被巨噬细胞、上皮细胞等吞噬，借以清除正常发育过程中死亡的细胞。细胞坏死则无此小体形成。但是并非所有发生程序性死亡的细胞皆形成凋亡小体。【仪器与试剂】射电子显微镜或扫描电子显微镜，组织切片机，离心机，离心涂片机 ...

DNA ladder法检测细胞凋亡 发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。【材料与试剂】凋亡细胞；蛋白酶K（500μg/ml）8mol/L 醋酸钾白细胞裂解液：pH8.0，10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaC ...

末端转移酶标记技术（TUNEL法）检测细胞凋亡【材料与试剂】（1）TUNEL试剂盒（Boehringer Mannheim公司产品）： ①从瓶2中取出标记液100μl分别作为两个阴性对照. ②将瓶1的全部溶液50μl加入瓶2剩余的450μl标记液中，使其成为500μl的TUNEL混合物。（2）POD转换液（一旦溶解，储存于4℃，不得再冻存）（3）漂洗液：PBS（4）固 ...

凋亡指数和细胞活力的定量测定（荧光染色法） 将细胞悬液与DNA结合的荧光染料混合，应用荧光显微镜观察以显示和计数伴有异常染色质的组织细胞。常用染料为丫啶橙，染色后可以检测整个细胞群中有多少细胞发生了凋亡，但不能区别活细胞和死细胞。因此将丫啶橙和溴化乙啶混合使用，根据两种染料的吸收情况可鉴定死、活细胞。【材料与试剂】100μg/ml丫啶橙或100μg/ml丫啶橙与100μg/ml溴化乙啶的混 ...

Caspase 3 活性测定（FIENA法）检测细胞凋亡 Caspase3 的激活在凋亡过程的细胞事件启动中起着重要作用，有证据表明，在蛋白酶级联切割过程中，Caspase 3处于核心位置。本法运用荧光酶联免疫吸附法（flurometric immunosorbent enzyme assay， FIENA）的原理， Caspase3激活后会作用于其特异的底物: 乙酰化天冬氨酸-谷氨酸- ...

荧光标记法检测细胞凋亡【仪器与试剂】（1） TdT酶（25U/μl）；（2） 生物素标记的-dUTP（Biotin-dUTP）或地高辛标记的dUTP （Digoxingening-11-dUTP）1nmol/μl；（3） 反应缓冲液；（4） 洗涤缓冲液；（5） 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素 （2 ...

靶细胞DNA片段的定量分析与杀伤细胞介导的细胞溶解试验 应用此法可以研究CTL、NK细胞介导的凋亡。通过125I-UdR和51Cr双标记细胞，可以同时检测DNA片段和溶解的细胞。【材料及材料】 (1) 125I-UdR标记细胞核和51Cr标记细胞浆的靶细胞：用完全RPMI-1640培养液配成5×104～1×105/ml的细胞悬液；(2) 未标记的CTL；CTL杀伤试 ...

Hoechst-PI染色法检测细胞凋亡 亚“G1”峰方法简便，但只是代表G0/G1期发生凋亡的细胞，S期和G2期细胞凋亡发生于G1峰后，无法观察。此外，由于全部细胞均经固定，因此不能区别死细胞和活细胞。Hoechst-PI染色则可弥补上述不足。Hoechst 33258 可被活细胞摄取，与DNA结合在紫外光下呈蓝色荧光。继而PI使死细胞着染产生红色荧光。因此在细胞二维直方图上根据红蓝两种荧 ...

凋亡细胞对胰蛋白酶和核糖核酸酶敏感性分析法如将活细胞与一定浓度的胰蛋白酶和核糖核酸酶温育，短时间内对细胞的形态、功能和活力几乎没有影响， 但坏死细胞以及细胞浆膜受到损伤的晚期凋亡细胞则可被这两种酶降解，使用流式细胞仪分析，可通过提高光散射、核酸或蛋白质荧光信号的阈值排除晚期凋亡细胞和坏死细胞，测定早期凋亡细胞。【材料与试剂】（1） 含Ca2+和Mg2+的Hanks平衡盐溶液（HB ...

以细胞为靶目标的噬菌体肽筛选材料与方法以筛选人肿瘤细胞特异性结合肽为例。 1．实验材料 (1)肽库：美国NewEnglandBiolabs的环状?肽库(Ph．D.-C7CTm Phage Display Peptide Library Kit)。 (2)人正常细胞株。 (3)人肿瘤细胞株。 2．实验器材和常用试剂同蛋白质分子为筛选靶目标的实验方法。 3． ...

肿瘤基因治疗的新策略 腺病毒是肿瘤基因治疗常用的载体，过去出于安全的考虑大多采用复制缺陷型腺病毒，但复制缺陷型腺病毒的作用仅仅是介导外源基因高效导人肿瘤细胞的载体。由于腺病毒在感染细胞中能诱发细胞凋亡，因此人们试图研制出能在肿瘤细胞中选择性扩增，最终诱导细胞凋亡的腺病毒，既保证基因治疗的安全性，又能在肿瘤组织中复制，从而增强杀伤肿瘤的效果。1996年，ONYX医药公司的Bischoff等人 ...

寻找组织工程的理想种子细胞 组织工程技术是应用细胞生物学和工程学的原理，将细胞在体外培养扩增后，接种至可降解的生物材料上，形成细胞-材料复合物，随着材料的逐步降解，细胞分泌细胞外基质，细胞就逐渐形成了相应的组织。将这种工程化的组织植入到缺损部位，可以修复和改善损伤组织的结构与功能，形成有活力的正常组织和器官，达到真正意义上的生物学重建。基于以上原理，种子细胞和生物材料将是组织工程技术的两大 ...

培养细胞常用固定剂和固定方法 培养细胞常用固定剂有4％多聚甲醛磷酸缓冲液、丙酮、甲醇和95％乙醇。在固定之前需用37℃预热的PBS轻洗细胞。 1．4％多聚甲醛磷酸缓冲液 固定10―20分钟，干燥。 2．甲醇 10‰甲醇固定5―20分钟，自然干燥。 3．丙酮 4℃冷丙酮固定组织穿透性和脱水性强，抗原保存好，很少用于组织切片，常用于培养细胞和细胞涂片的固定，平时丙 ...

组织常用固定剂和固定方法 1．甲醛 是常用的醛类固定剂，甲醛(formaldehyde)通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥(-CH2-)，蛋白质不再发生改变，保存原位。其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，分子间交联形成的网络结构可能部分和完全遮 ...

组织和细胞的固定方法 固定的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。固定还能增加组织块硬度，使其更容易切片，使不同的结构更容易染色。 固定方法有物理固定和化学固定两类，物理固定可采用空气干燥(血涂片)、骤冷(在液氮中迅速冷冻)或微波固定等；化学固定有浸润法(immersion method)和灌流法(perfusion ...

Feulgen反应原理及Sohiff液的配制 Feulgen反应是显示DNA的经典而特异的染色方法，由Feulgen(孚尔根)在1924年提出，因而得名。(一)Feulgen反应原理 DNA可在酸性条件下水解，嘌呤―脱氧核糖之间的糖苷键断开，形成醛基(―CHO)，再用 显示醛基的特异性试剂Schiff试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。DNA 经稀盐酸处理而水解。除 ...

吖啶橙原值区分组织细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法 1．溶液制备 (1)0．1％吖啶橙浓缩液(避光，4℃保存) 吖啶橙 0．1g 双蒸水 100ml (2)0．067mol／L磷酸盐缓冲液(pH 6．0) 双蒸水 90ml 磷酸氢二钠(Na2 HP04・12H20) 0．34g 磷酸二氢钾(KH2P04) ...