细胞技术

flhua 今天看文献，看到有人用这样MycHis-tagged载体，不知是何原理，请大家解释一下。这是我刚才查到的内容：“载体名称：pcDNA3.1/myc-His载体类型：哺乳动物细胞表达载体: 载体大小：5.5kb (5493 bp)载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells）细菌抗性：氨苄西林（Ampicillin）真核筛选标记：新霉素（Neomycin）5' 测序引物：T7 prime3' 测序引物：BGH primer ...

w_dennis 请教各位高人前辈，有做过基因的部分核苷酸缺失后，回补株构建实验吗？如何操作？请教下pBAD/gⅢ和pBR322质粒构建回补株的原理？叩谢！！:)woxingwosu 看看这个有没有帮助了：http://journal.shouxi.net/qikan/article.php?id=534304w_dennis 谢谢，请问有pBAD/gⅢ和pBR322质粒的信息吗？本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以 ...

proteining 如题，我的实验是缺氧复氧处理脐静脉内皮细胞，一组实验细胞给予适当剂量的P38抑制剂SB203580，在进行缺氧复氧，另外一组不加直接缺氧复氧处理，（另外组此处略去），我得出的结论是加入SB203580预处理的组，其磷酸化的P38的水平显著低于未加SB203580组，也就是它可以抑制P38的磷酸化，我看国内外大部分的实验也是得出的中国结论，但是审稿人却找出了一篇99年BBRC的文献，来质疑我的 ...

谁似我醉扬州 我想证明某种药物诱导成骨与经典Wnt通路有关，实验应该怎么设计？需要测哪几个指标？cyclin 特异性抑制剂阻断wnt通路中的一些关键性分子，看药物处理对成骨的影响，以及检测药物诱导是否会激活wnt通路中的关键分子j19s87x 我们公司可以为你做完整个课题，有需要联系QQ：594051497本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号： ...

yn850307 请大家帮忙提供G418筛选的具体步骤和注意事项。谢谢！zhujoker 筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码 ...

xxshc 我有A蛋白的转基因鼠和对照鼠。想证明A蛋白参与anti CD3激活的T细胞受体TCR信号通路。TCR激活后可以激活ras，MEKK,MEKKK等。是不是我首先看各通路下游的蛋白磷酸化水平在两种鼠之间有无差异。有差异再向上寻找？是可以通过这个初步筛选吗？第一次做信号通路，希望得到大家的帮助。谢谢！kern6549 先不要找参与哪一条通道，先要确定是否参与anti CD3激活的T细胞受体TCR信号通道。可以用常规的活 ...

heward N-乙酰半胱氨酸DMEM配成50mM母液，NaOH调PH值6.8，然后稀释成10mM、5mM、2.5mM加到大鼠原代肝细胞中，即使不加肝损伤药，单加N-乙酰半胱氨酸，细胞的存活率也在降，与药合用后细胞存活率降得更多，为什么？请教高手，NAC不是对肝损伤有保护作用么？怎么按照上面的方法加了下反而增加毒性？kern6549 不知道你说的单加NAC细胞的存活率也在降的结果是怎么得出来的？有没有设置NAC浓度为0的对 ...

xjcaoliqiong 各位战友，IL-10等细胞因子在组织中检测能否不经过培养，直接匀浆提上清液做免疫组化？刚刚接触实验的新手衷心请教，谢谢！kern6549 两种方法：1、免疫组化检测IL-10。2、组织匀浆ELISA检测IL-10。请不要相混，匀浆还怎么做免疫组化。xjcaoliqiong 谢谢了！zaiju512 呵呵非专业选手wuushark 细胞提cdna，QT-PCR也可以测。本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意 ...

neuroclong 谁能告诉我一下casepase-independent cell death有哪些，查了相关文献查不到，我写东西到最关键的地方，就是差找个了，急啊急，有哪个高人给我讲一下吧kern6549 个人意见，仅供参考：caspase-dependent cell death应该指的就是凋亡吧。那么caspase-independent cell death可能就是除了凋亡外的细胞死亡，如坏死，自噬等。neuroclong 当然是凋亡 ...

wachjun2000 请教各位高手，我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。但是我在查文献及抗体的时候发现以下几个问题：1、NF-KB p65存在不存在磷酸化？如果不存在磷酸化为什么抗体公司用磷酸化抗体？2、一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF ...

janetlee1976 在构建萤光素酶报告基因载体的过程中，我把一个基因的一部分启动子插入到载体中（包含该基因转录起始点），请问是否需要为了避免载体中编码萤光素酶的基因的移码突变，而在转录起始点以下所包含的碱基数必须为3的整倍数呢？比如所包含启动子区域为-1000！~+27（此处是否必须为3的整倍数）woxingwosu 我觉得只要从翻译开始，即ATG， 保持碱基数必须为3的整倍数就可以了。前面的启动子部分没有必要。最好要 ...

清泉煎 本人研究生即将学习生物化学与分子生物学，本科还没有基础，求高手指点，现在应该做好什么准备工作freecell 先买一本本科的教材，仔细自学一下。pengqianjin 以我的经验，最后买这些教材：无机化学、有机化学、生物化学，真正静下心来好好研读，一般3个月就差不多了。无机化学是比较基础的，跟高中学的化学有一定联系。有机化学又是以无机化学为基础。devil19840 用不着从无机化学、有机化学开始学，直接拿一本权威的生物 ...

wachjun2000 请教各位高手！我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。但是我在查文献及抗体的时候发现以下几个问题：1、NF-KB p65存在不存在磷酸化？如果不存在磷酸化为什么抗体公司用磷酸化抗体？2、一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF ...

第一号 园子里的各位战友及版主：本人在做抑制ＭＡＰＫ通道，对甲状腺癌细胞分化的影响。使用的抑制剂是U0126，按照文献报道，浓度是10um。但在加药后24h,可见细胞大量的漂浮（已排除污染），而国外文献报道，U0126要持续作用5天，且每天更换新液。请问，U0126对细胞有无毒性？为何我的细胞在作用24h后就见大量死亡？各位战友及版主能帮我分析分析吗？苍茫云海间 当然有毒，要做一剂量效应实验， dose-dependent effe ...

zcy20002001 请问上海哪里有可以做细胞低氧培养的地方，本人想做低氧条件下细胞的信号转导，谢谢！j19s87x 有意可以联系我QQ：59405497 以前做过，也在上海zcy20002001 没有QQ号，请问你在上海哪个大学或研究所，或者留一个msn细胞超人 现在很多人都在作信号转导 ，我女朋友博士课题也是在做，挺麻烦的，要做很长时间常能出结果，你去别人那儿做是啥意思，花钱用人家设备，还是跟他们老师合作。北京这边很多也是做低 ...

ontheway361 最近的实验想从细胞中提取RNA，然后进行逆转录PCR从而测定细胞中bcl-2的表达，进而探讨凋亡的机制。可是该过程中遇到一棘手问题：我对细胞进行干预后，按照trizol试剂盒提取RNA说明，加入trizol液之前要先吸去培养液；然而，此过程中肯定不可避免地将凋亡细胞吸掉了，那么请问各位前辈，这样做的话是否会影响后续结果，从而影响对RNA表达的误判呢？还有一点，请问bcl-2，caspase-3 ...

jianglitcm 我们的试验中要给180-220g大鼠侧脑室注射H89以阻断Pka再观察药物的抗抑郁作用，我之前查到的文献中只有小鼠海马注射H89的量，为5.19ug/ul，那么大鼠的注射剂量如何定？注射5ul够吗？另外，我需要用药物治疗三周，那么H89是这三周内都要给药还是在治疗前给一次就够了呢？向各位专家大侠赐教！感激不尽！鱼cynthia 麻烦问一下 你的H89是用什么稀释的chenlinghezzx 应该是先用D ...

幽幽草sky 有谁用流式细胞仪检测过STAT-5磷酸化程度呀，求教具体方法，结果怎么样呀？kern6549 1、制备样品细胞的单细胞悬液。2、多聚甲醛固定细胞。3、打孔剂在细胞膜上打孔。4、标记荧光素偶联的抗磷酸化STAT-5抗体。5、流式上样分析。Crucial role of interleukin-7 in T helper type 17 survival and expansion in autoimmune disease. Nature Medicine. 2010. 16(2):1 ...

sharon_yin 现在手头有一批病人的血清和血浆，想做些什么，不知道最近有什么比较火的？？zhujoker 多看看nature，cell，sience，你可能就知道到可以做点什么了？LoftyMan 都是些什么狗血的问题和回答啊，你手上有菜刀就能表示你刀工出神入化可以在最新的电视节目上亮相，做梦吧看几篇Nature就能知道怎么做，做梦吧版主zhujoker留言:请您在回答问题时更加注重问题的本身!sharon_yin 你们 ...

tianlang126 :(:(新手最近想做细胞自噬，想知道beclin1在自噬中起个什么样的作用？是不是表达beclin1就可以认为细胞发生了自噬？它和凋亡、坏死、炎症等有什么关系？它是通过什么信号通路起作用？希望各位大虾解解惑:8):8)李一晶晶 你好，目前我也在做， 请问你做pcr没有啊，187338186，我的QQguodanni tianlang126 wrote::(:(新手最近想做细胞自噬，想知道beclin1在自噬中起个什么 ...