生物化学技术

问：我是做脂肪酶克隆表达的。现在已经将目的基因整合到毕赤酵母GS115中，可是几番诱导下来，就是没有酶活。现在小弟想请教各位战友几个脂肪酶活性检测的问题，怕是表达出来，因为检测方法有误。 1、诱导培养基BMMY的磷酸缓冲液浓度为100mmol/L，请问这个浓度是不是太高？如果脂肪酶表达量很低的话，测定过程中产生的游离脂肪酸也很少。如果活性测定的磷酸缓冲液浓度太高的话，会不会影响测定结果，也就是说将 ...

问：脂肪酶的测定方法有哪些？我的脂肪酶可能活性会很低，我要较灵敏的测定方法。 答：NaOH滴定法、酶标法、分光光度计法等等，有很多，国内相关的论文也有很多。 ...

问：我将脂肪酶固定在大孔吸附树脂D3520并干燥后，想测脂肪酶的酶活。可是树脂干燥后，再放入脂肪酶的反应体系后，树脂颗粒都漂在上面而不混合。请问这种情况下该如何测酶活？（氢氧化钠滴定法测酶活） 另外，即使我测酶活完毕，该怎样将树脂回收呢？直接将反应液过滤，酒精洗涤？请各位战友指教，谢谢！！ 答：我没有做过固定化，是不是你把大孔树脂干燥的过头了呢？你如何控制的条件啊？你可以用三丁酸甘油酯的平板粗略 ...

问：我在脂肪酶侧活方法上遇到很多问题，比如如何测定酸性脂肪酶的活性，发酵液的稀释倍数与酶活力并不成梯度，应该以哪个为最后的测定结果。谢谢各位战友的指教！ 答：我测定的酶活的范围是数千到上万 IU/ml；测的时候用的NaOH溶液的摩尔浓度是 0.05 M 这样的话根据酶活的定义最后的酶活公式就可以折算成IU/ml= undefined△V（样品和空白样的差值）n~A稀释倍数)。 滴定样品和空白样的差值一般控制在 ...

问：有人做过乳中脂肪酶的检测吗？除了传统的滴定法外，还有更好的方法吗？ 答：乳中脂肪酶没有测过，不过微生物脂肪酶可以用pNPP（对硝基苯棕榈酸酯）测吸光度法测活。 答：做过胰脂肪酶，可用同位素或者荧光 ...

问：我正在做这个试验，买了从C2-C16的不同的对硝基苯酚底物，但是令我困惑的是，C10以下的底物，很容易在缓冲液中自发水解，这样就干扰酶活测定。而大于C10的底物又都很难溶解。很是困惑！请问各位做过这项试验的大虾给予我一定的帮助，不甚感激！ 答：30毫克的对棕榈酸硝基苯酯（p-NPP）可以溶于10毫升的异丙醇中，稍微水浴加热就可以完全溶解。我是以（p-NPP）为底物，溶液A：30毫克的对棕榈酸硝 ...

问：向大家请教脂肪酶活力的测定方法、仪器、试剂。多谢指教！ 答：这是我从一篇文献中找到的。用酸价作指标， 用95%乙醇作终止剂， 通过酸价的测定反映脂肪酶分解脂肪的程度， 从而求得酶活力。 方法： 1、粗酶液的制备 用电子天平分别称取粗脂肪酶0.010 g、0.020 g 和0.030 g， 用蒸馏水溶解并定容至100 mL， 配成浓度分别为0.01%、0.02% 和0.03%的粗酶液。 2、实 ...

问：现在我用的南京建成的试剂盒来测脂肪酶，可是结果可以说是乱七八糟，一点也不稳定，这个问题也咨询过几位师兄，也有类似情况发生。不知道各位战友有没有碰到过这种情况？可有解决办法或者其他的测定方法？能否传授一下小弟？不胜感激！ 答：我也用过南京建成的试剂盒，结果和你一样，看来试剂盒测脂肪酶还很不成熟。你可用常规方法（聚乙烯醇橄榄油乳化法），方法简单可靠，到处都能查到此方法。 答：乙烯醇的办法我试过， ...

问：向大家请教脂肪酶活力的测定方法、仪器、试剂。多谢指教！ 答：可以考虑采用 橄 榄 油乳化液法测定脂肪酶的活力，具体步骤如下：取100 ml三角瓶4个，每瓶加人5 mL磷酸缓冲液（pH= 7.5 0.02 5mol/1）和4m l，聚乙烯醇橄榄油乳化液，置于37 C水浴中保温5 min，然后在两个瓶中各加人1 MI.酶液，从加人酶液开始精确计算时间，继续保温10 min，取出后立即加入95% ...

问：各位大侠能不能告诉我碱性磷酸酯酶标记的蛋白A和IgG二者在elisa中有何区别！它们的实验效果有什么不同？ 答；是有所不同的，前者是运用蛋白A与抗体（可以是各种可与抗原反应免疫球蛋白）的fc'片断进行非特异性的结合而起到代替二抗的效果。而IgG是针对一抗（主要是某一特定的与抗原反应的Ig，可能会因为轻链的相同的产生交叉反应）的抗抗体，其反应是特异性的。 因而在实验中要根据你的需要来做选择，前者 ...

问：我要做不同辣椒品种酯酶同工酶差异性分析，电泳实验的聚丙稀酰胺凝胶中到底需要加SDS吗？我只知道加了是按分子量大小分离的，不加的话电荷也能影响酯酶在胶板中的迁移速度，我查的酯酶同工酶资料中有些加了SDS，有些没有加，到底加不加呀？望高手指教！ 答：加与不加都有意义。加了SDS后蛋白就会变性，SDS能打断氢键和疏水键，上样Buffer中的还原剂巯基乙醇或DTT则能够破坏蛋白质二硫键，使蛋白的构象和 ...

问：我做的是细胞，单核细胞的，怎么自己去做呢？我想自己做，谢谢！很麻烦吗？ 答：目前用酶组织化学方法标记单核细胞做的人比较少，可考虑采用免疫细胞化学技术，如用CD68， alpha-AT， lysozyme等抗体。 答：我也在查这方面的，单核细胞的标记问题，现在查到的是可以用hoechst标记，Hoechst是能与DNA A—T碱基对特异性结合的双苯并咪唑荧光染料，细胞核着色，紫外光激 ...

激酶（kinase）：是能够在ATP和任何一种底物之间起催化作用，转移磷酸基团的一类酶。ATP有三个磷酸基团，其中两个是通过一个高能磷酸键结合，激酶的作用是催化这个高能磷酸键的水解，并利用释放出来的能量，将一个磷酸基团转移到底物分子上。值得一提的是，激酶的活性需要镁离子的存在，因为参与激酶反应需要镁离子和ATP形成Mg—ATP复合物。 ATP＋底物——&mdas ...

问：龙葵碱中毒可以抗胆碱酯酶抑制作用，是不是就是说对抗了胆碱酯酶分解胆碱的作用？从而是胆碱积蓄，造成中毒症状？那么有一种药物去代替胆碱酯酶去分解胆碱，就可以解毒了是不是？那么龙葵碱中毒的机理就和蛇毒中毒的机理是不是一样的？那么请问各位有没有这样的药物可以起到这样的作用呢？它的化学成分是什么呢？ 答：1、龙葵碱为生物碱，是从茄科植物龙葵的全草或未成熟的果实中提取分离出的一种生物碱．有阻止胆碱酯酶活性 ...

问：关于胆碱酯酶，我科用的是试纸条法，参考值20-80U，而今天一老大夫来提意见，说我们的报告不规范！应当报告胆碱酯酶活性百分数，还有什么轻度有机磷农药中毒为正常的50—7%，中度中毒为30—50%，重度中毒多在30%以下。慢性有机磷农药中毒全血胆碱酯酶活性在50%以下。等等。 这是怎样的一种报告方法呢，其中的百分数又是怎样得出的呢？ 我个人的意见是：这是一种较老的病情分类 ...

问：本人想写一篇关于有机磷中毒的文章，可是胆碱酯酶的测定是用KU/ml来表达，而有机磷中毒的分级却用百分比来表示，其中有换算公式吗？求助哪位大师帮忙解释。谢谢！ 答：我认为楼主可以取你单位实验室胆碱酯酶正常值范围的平均值，用病人测定值与之比较得出百分比，这个问题好像从来没有书籍提到过，我看了一下第五版《诊断学》，其中讲到有机磷中毒分级时指的是正常平均值的百分比。 ...

我自己做的幻灯片，与大家分享。 ...

问：我想利用乙酰胆碱酯酶染色将小鼠结肠平滑肌中的胆碱能神经显示出来，并用软件作定量分析，但不知该染色方法所用试剂及具体方法，上海何处可做该染色？请各位大侠帮帮忙！ 另不知这种方法与将肠黏膜匀浆后测定乙酰胆碱酯酶，那一种更好？谢谢！ 答：乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase） 染色步骤 1、下述溶液内孵育15分钟37C 碘化乙酰硫胆碱 12.5 mg 蒸馏水 2.5 ml 0 ...

问：红细胞膜上的乙酰胆碱酯酶的检测，还有血液的保存。知道一点信息的请联系我哦。 答：红细胞乙酰胆碱酯酶的简写为AChE。 用AChE催化底物乙酰巯基胆碱（ACTI），生成巯基胆碱，蓝色的氧化型二氯酚吲哚酚（DPIP）被还原成无色化合物，在600nm处监测吸光度变化即可测定AChE活力单位。结果 在日立7060生分分析仪上测定85例健康人AChE，参考值为46.6-61.6U/gHb。批内CV2.2 ...

问：这可能是一个非常初级的问题，但查了几本书却无任何信息，文献上都是轻描淡写地一提，好像是太原始了似的。可是，我真的不知道该方法如何操作——酯酶浓度，配方以及染色时间等等，盼各位战友的回音。谢谢。 答：以前做过，是做淋巴细胞的。不过巨噬细胞方法一样的，更容易出结果。 非特异性酯酶一固定液 甲醛-丙酮缓冲液(PH=6.6)Na2HPO4 20mg，12 ， 50 ...