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        对硝基苯酚pNPP测脂肪酶酶活

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        问:我正在做这个试验,买了从C2-C16的不同的对硝基苯酚底物,但是令我困惑的是,C10以下的底物,很容易在缓冲液中自发水解,这样就干扰酶活测定。而大于C10的底物又都很难溶解。很是困惑!请问各位做过这项试验的大虾给予我一定的帮助,不甚感激!

        答:30毫克的对棕榈酸硝基苯酯(p-NPP)可以溶于10毫升的异丙醇中,稍微水浴加热就可以完全溶解。我是以(p-NPP)为底物,溶液A:30毫克的对棕榈酸硝基苯酯(p-NPP)可以溶于10毫升的异丙醇中。溶液B:含1%triton的磷酸缓冲溶液。溶液A与溶液B1:9混合(现配)。

        我现在实验中遇到的问题是:测酶活的底物溶液是无色的,但一加发酵液溶液立刻变为黄色,测量的吸收光值特别大,但把发酵液煮沸20分钟后作对照底物溶液不变色,用碱地定测得脂肪酶活力不高。用标准脂肪酶没有这个现象。实验很郁闷!不知是什么引起底物的变化。

        请问各位做过这项试验的大虾给予我一定的帮助,不甚感激!

        答:我认为用对硝基苯酚脂肪酸酯底物测定脂肪酶活力是非常灵敏的,我不太明白二楼的困惑,从你的描述来看,你的发酵液里应该有酶活才对。用碱滴定测得脂肪酶活力不高。正常啊,因为PNPP法是比较灵敏的,所以即使你用PNPP法发现颜色反应非常的黄,其用碱滴定可能酶活也比较低。这是我的实验结论,不知道是不是符合大家的经验。

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