生物化学技术

基因表达系列分析（SAGE）是通过快速和详细分析成千上万个EST（express sequenced tags）来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。再次访法中，通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA（10-14bp）标签，并通过PCR扩增和连接，随后对连接题进行测序。SAGE大大简化和加快了3’端表达序列标签的收集和测序。同DD一样，SAGE是一个“开放”的系统，可以发现新的未知的序列。在进 ...

(1) 目的基因组DNA片段的制备 基本原则：DNA片段之间存在部分重叠序列；DNA片段大小均一。　 分离和纯化真核生物基因组DNA时，通常采用蛋白酶分解和有机相抽提的方法除掉蛋白质及脂类等其他大分子。基因组DNA片段化则主要采用物理剪切法和限制性内切酶法。 (2)外源DNA片段的全克隆选择适宜的载体，与外源DNA片段相连。常用的载体有质粒、噬菌体、粘粒（cosmid）以及YAC。这些载体可以 ...

随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。 差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cD ...

差别杂交(differential hybridization)又叫差别筛选(differential screening)，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。从本质上讲，差别杂交也是属于核酸杂交的范畴。它特别适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，同时亦可有效地用来分离经特殊处理 ...

在RNA凝胶电泳之前，先用乙二醛等变性剂处理RNA，再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂，然后进行杂交。试剂：乙二醛：4mol/L（约为30%），经过阴阳离子交换树脂纯化，使pH为5.5～6.0磷酸缓冲液：80mmol/L pH6.5～7.0 磷酸缓冲液：10mmol/L pH6.5～7.0Tris-HCl:20mmol/L pH7.8 二甲基亚砜：分析纯 ...

化学法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。在基因的化学合成中，通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。 磷酸二酯法基本原理是将一个5’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个3’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷 ...

合成基因目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以根据需要合成出具有实际应用和研究价值的多肽和蛋白质基因。已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素II、集落刺激因子等，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。合成基因的方式1 全基因合成：分子较小而又不易得到的基因采用该方式。将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成基因在100个核苷酸以上时 ...

限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶Ⅰ 或其大片段（Klenow）①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA的第二链③填补双链DNA3’凹端④DNA序列分析 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） 聚合酶链反应（PCR） DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 多核苷酸激酶 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 末端转移酶 在3’末端加入同质多聚物尾S ...

DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置，而且能测定分子量。试剂：变性液：0.5mol/L NaOH 1.5mol/L NaCl中和液：1mol/L Tris-HCl 1.5mol/L NaCl pH8.020×SSC:0.3 ...

质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的荷质比（m/e）的差异来分离并确定分子量。其原理并不新鲜，但是在80年代早期出现的两种新的离子化技术，使质谱从仅能分析小分子挥发物质到可以研究生武打分子，80年代末又发明了两种更新的离子化技术，一种是介质辅助的激光解吸/离子化（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI），另一种是电喷雾离 ...

1 DNA纯度在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。2 核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。不同限制性内切酶对NaCl浓 ...

双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达 ...

1. 离子交换剂的选择　　在阳离子交换剂中以磺酸型应用最广，它在酸及中性溶液中均可使用，简单及复杂的无机及有机离子都可交换，但带正电荷的胶体和高分子的阳离子则不能被交换和交换很少.　　2. 交换剂的处理及转型　　商品的树脂是干树脂，使用前要用水浸泡使之充分吸水膨胀，又因含有一些水不溶性的杂质，故要用酸、碱处理树脂。步骤如下：干树脂用水浸泡两小时后减压抽去气泡，倾去水，用无离子水洗至澄清，倾去水后加 ...

通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。对临床组织样本进行研 ...

1、在线服务：Primer DesignPrimer3 (Whitehead Inst MIT)CODEHOP (Degenerate primers)ClustalW Multiple sequence alignment2、软件使用：BIMAS - BioInformatics & Molecular Analysis Section NIHbioinformatics.org - The O ...

细胞培养方法 Invitrogen life technologies 细胞培养液 Invitrogen life technologies培养液检索 ATCC 用的数千种不同培养液参考表：特殊细胞需要的生长因子 Invitrogen life technologies组织培养方法 Bradley Lab at Baylor College of Medicine 基础细胞培养方法 QIAGEN国 ...

1、骨架和细胞分裂 Kevin Sullivan's 实验室 酵母菌内SPB 和微管动力学 酵母菌中肌动蛋白的动力果蝇中MEI-S332蛋白果蝇有丝分裂和mRNA运输网丙菌属细胞骨架RNA剪切因子的核内运输网丙菌属的趋化作用网丙菌属中细胞骨架动力和细胞运动核动力网丙菌属中细胞动力细胞骨架动力和胞内运输 2、细胞器动力学和泡囊运输用GFP显示小囊运输用GFP观察TGN运输细胞骨架动力学和胞内运输 ...

基因敲除（gene knockout/gene targeting)Phenotypic silencing of cytoplasmic genes using sequence-specific double-stranded short interfering RNAGene Targeting OutlineC elegans gene knockout protocols1C elega ...

一、RAPD技术的原理RAPD技术是由美国的Williams等人于1990年发明的。它是以聚合酶链反应技术(PCR技术)为基础，利用人工合成的寡核苷酸为引物，以从组织中分离出来的基因组DNA为模板，通过基因放大器合成多态性DNA片段的一种方法。由于不同品种DNA序列存在着差异，其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异，这样经PCR扩增后就产生了DNA片段的多态性，从而形成了RAPD标记。RA ...

PCR是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与PCR诞生的资深研究员Henry Erlich所言”在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业”(PCR allows people to practice molecular biology without a liscence)。也因此，活用及慎用PCR是确保一定品质的必要条件。PCR本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的 ...