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        DNA的吸印转移法(Southern Blot)

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        DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后,放入碱性溶液中使其变性,将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上,然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置,而且能测定分子量。
        试剂:变性液:0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
        中和液:1mol/L Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0
        20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/L NaCl

        1.电泳   
        取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切,电泳鉴定酶切完全后, 取酶消化后的DNA点样于0.8%~1.2%的凝胶上,以0.8~1V/cm电压电泳过夜,在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转,紫外灯照射10~20min后拍照。
        2.变性与中和   
        将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。
        蒸馏水洗胶1min,将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。
        3.转移   
        取托盘一只,放入10×SSC溶液约500~1000ml,托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃,取一长方形滤纸搭在桥上,两边浸入10×SSC溶液中,仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡(用玻棒在滤纸上滚动)。将凝胶放在滤纸上,去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上(如NC膜浸湿不均匀,则考虑更换NC膜,操作时手切勿触及NC膜),去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸(长和宽均比NC膜小1mm)放在NC膜上,仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小,重叠放在滤纸上,再压一重物约500~1000g。转膜24h,中间更换吸水纸。
        4.固定   
        用2×SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶,让膜自然晾干。将凝胶放入EB液中30min,取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80℃烤膜2h,然后将膜封入塑料袋进行杂交。

         

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