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        影响限制性内切酶活性的因素

        互联网

        11084

        1 DNA 纯度
        DNA 样品中若含有蛋白质,或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、 EDTA SDS 、酚、氯仿和某些高浓度金属离子,均会降低限制酶的催化活性,甚至使限制酶不起作用。

         

        2 核酸内切限制酶的缓冲液
        核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、 Tris-HCL 、巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT) 以及牛血清白蛋白 (BSA) 等。
        使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。
        不同限制性内切酶对 NaCl 浓度的要求不同,这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液,在进行双酶解或多酶解时,若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好,则几种酶可同时酶切;若这些酶所要求的缓冲液有所不同,可采用以下三种方法进行消化反应:先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化 DNA ,然后补足适量的 NaCl ,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化;
        先用一种酶进行酶解,然后用乙醇沉淀酶解产物,再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。

         

        3 酶切消化反应的温度
        DNA 消化反应的温度,是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶,具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是 37℃ ,少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于 37℃

         

        4 DNA 的分子结构
        DNA 分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响,如消化超螺旋的 DNA 比消化线性 DNA 用酶量要高出许多倍。
        有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点,其效率也有明显差异。
        限制性内切酶反应的终止 通常是采用 65℃ 条件下温浴 5min
        加终止反应液(如 0.5mol/L EDTA 使之在溶液中的终浓度达到 10 mol/L )螯合 Mg2 ,以终止反应。

         

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