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        基因的化学合成

        互联网

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        化学法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。在基因的化学合成中,通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法,以及在后者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。

         

         

         

        磷酸二酯法

         

        基本原理是将一个 5 ’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个 3 ’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来,形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。

         

         

         

        亚磷酸三酯法

         

        原理是将所要合成的寡核苷酸链的 3 ’末端先以 3 -OH 与一个不溶性载体,如多孔玻璃珠连接,然后依次从 3 -5 ’的方向将核苷酸单体加上去,所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的,其中 5 -OH 4,4- 二对甲氧基三苯基保护, 3 - 端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的 OH ,用甲基或 ? 氰乙基保护。

         

        寡核苷酸连接法

         

        目前,化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于 150-200bp ,而绝大多数基因的大小超过了这个范围,因此,需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。

         

         

         

        常用的基因组装方法主要有两种:

        第一种方法是将寡聚核苷酸激活,带上必要的 5 - 磷酸基团,然后与相应的互补寡核苷酸片段退火,形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段,再用 T4DNA 连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。

        第二种方法是将两条具有互补 3 ’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火,所产生的单链 DNA 作为模板在大肠杆菌 DNA 聚合酶 Klenow 片段作用下,合成出相应的互补链,所形成的双链 DNA 片段,可经处理插入适当的载体上。

         

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