蛋白质技术

bluesky0902 请教各位：为什么条带这么不清晰呢？而Marker还可以，是电泳的问题，胶的问题还是染色的问题呢？刚开始做，是在搞不明白~·电泳是非变性聚丙烯，染色步骤如下：染色步骤：1. 固定液：100%冰醋酸2ml，无水乙醇40ml加水至400ml，摇7-8min2. 银染液：0.6g硝酸银加水至300ml，摇12-15min3. 加水洗1-2次，每次1min4. 显色液：6g NaOH，4ml甲醛，1%硫代硫酸钠800ul，加水至400ml ...

0534130323 请求高手：实验中细胞受刺激之后一些相关细胞因子分泌增多，我用药物处理之后这些细胞因子分泌减少了。我往上追溯其作用机制，分别检测相关调控基因的蛋白表达和mRNA表达情况。结果发现药物只影响基因的蛋白表达，对其mRNA却没有影响。请问这该如何解释？霍一刀hxs 影响翻译而不影响转录，很正常的调控方式。0534130323 非常感谢whatisever 也可能只影响蛋白的稳定性。济南基美 降解被抑制了本文由丁香 ...

viola2010 您好，我是新手，请问核蛋白如何提取？试剂盒那个公司较好？kkndd 不用试剂盒，这篇1989年的文章的方法，我们实验室现在还在用，非常有效，非常简单，Nucleic. Acids. Res. (1989) 17: 6419. (PMID: 2771659)这是一篇比较新的文章，用的也是那篇89年的方法，Mol. Cell. Biol. (2000) 20: 8783-92. (PMID: 11073979)xhjggl 上海生工的 BSP009shylook 很多kit都可以用呀 ...

liuxinfanjian 提两个幼稚的问题：1、如果用hela细胞或者293细胞做工具细胞，做双荧光素酶的时候，3'-UTR端的扩增要以hela细胞或者293细胞的cDNA为模版呢还是以大鼠cDNA为模版呢？ 我我的我我的模型是大鼠的。2、mimics和inhibitor是不是只要大鼠和人的miRNA序列一致，就可以在人和大鼠之间通用呢？ zhujoker 、如果用hela细胞或者293细胞做工具细胞，做双荧光素 ...

xylish1 菜鸟一枚，目前要做HER-2（膜蛋白，185KD）western blot ，求教各位，一抗哪个公司的好？使用时抗体浓度，转膜时间及注意事项，多谢！zhe992000 搭车求助，我想验证肿瘤组织中透明质酸（hyaluronan）的表达水平，这是一个糖蛋白，主要在细胞外基质中表达。在文献上一般是通过透明质酸合成酶的水平 或者透明质酸水解酶的水平来间接判断透明质酸的表达水平，我想直接测定透明质酸的表达量，不知道能不能做we ...

wx275411643 麻烦哪位高手帮助解答一下我现在做WB遇到的情况，我买的抗体说明书上写的目的条带分子量和实际曝光出来的不一样，Marker肯定没问题了，是国内公司的抗体，问过公司，他们说是蛋白被修饰了，所以会大点。我做的结果比说明书上的大了大概10KD（书上说39KD），不知道公司的解释能不能接受？抗体是多克隆的。就怕他们用别的抗体冒充我要的。zhe992000 看看你的蛋白质的分子量有没有问题？好多时候，蛋白在 ...

364587256 向各位战友求教：看过多篇英文文献，关于p-AKT的western blot检测时间，有的为1-2小时，有的却有24小时，差别之大，想知道原因。见到以前战友问过类似问题，可是关于这个时间点的把握始终弄不明白，还望实验室大虾不吝指教！ly86400 啊？我们就是用常规做法。。检测的效果还可以啊~你的检测时间是什么概念啊？364587256 ly86400 wrote:啊？我们就是用常规做法。。检测的效果还可以啊~你的检测时 ...

小瘪瘪 我现在要做细胞色素C(cyt C)的western ，买的抗体型号是SC-13156，请问有人用这个抗体么？怎么样？我要做这个，蛋白预染marker要买多大的？就是要根据cyt C的蛋白大小而定。还有就是做cyt C一抗的稀释度是多少？请有经验的前辈高手指！！yangbxys 没有做过cyt C，但是做过WB。每次买抗体，都有说明书，说明书会告诉你比如做WB时出现条带的大小，已经建议的WB稀释浓度。建议lz好好看看说明书。林杉2012 ...

xiaonichi 我现在在做一个蛋白，命名为fkbp38，按道理应该是38kd。因为同家族的fkbp12为108aa，约12kd但现在在ncbi上找到的序列，人的有413个aa，显示的分子量为44-45kd左右这是啥原因呢？xianyuanshan 楼主找到的是这个吗？—— NP_036313peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP8 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protei ...

qingyu2010 打算挑战一下传说中的EMSA所以需要学习提取核蛋白了~不过因为还是菜鸟所以有个小问题。。。我想先做western检验一下核蛋白和胞质蛋白分离的好不好，该选择什么蛋白来检测呢？当然最好能是常用的或者以后也用的上抗体的蛋白啦~对于核蛋白，是不是用histone或者laminin或者大多数转录因子都可以？Thermo的网页上给的是OCT-1，某文献里是SP-1，我用c-Jun之类的OK么?_?对于胞质 ...

qqljwar 各位战友：小弟想通过蛋白水平去检测胃泌素的表达量，但不知道具体用什么方法，有没有哪位前辈做过这方面的检测，指导下小弟，感激涕零啊！forest22939 Western blot is direct method, second is choosing subtract.qqljwar forest22939:你好，胃泌素比较小，好像只要2kd左右，Western检测的效果不是很好，另外你说的subtract 是什么，忘赐教！ 谢谢。本文由丁香园论 ...

liufengxi 最近使用pEGFP(增强型绿色荧光蛋白基因)做的转染，虽然转染细胞阳性率不低，但是绿色荧光蛋白表达跟以前相比较很少（转染剂量是一样的）。最初怀疑是细胞状态问题，重新复苏细胞后，没有改善；后将Hela细胞换为HepG 2细胞后，结果仍然不理想。我怀疑是不是我们的质粒突变了呢，就是转录或者是表达蛋白的能力下降。因为有一批提的质粒做的转染根本没有表达。请大虾们给支支招哈！思路迪病毒 liufengxi wrote: ...

米宝 这俩天做实验，极其郁闷。我做的总AKt和pAkt,大鼠脑组织，第一次跑总AKT的时候，我觉得可能是因为蛋白是提取的浓度比较好吧，出来了一条浓浓的条带，三组总AKt都出了，接下来做pAkt,就出了一个带，效果挺明显的。后来再做pAkt的时候，跑了4张膜，显影的时候，太干净了，上面什么都没有，甚至连个杂带，斑点 都没！实验是在实验员的领导下完成的，技术上基本没什么纰漏，查阅本版面有关这问题方面的介绍，有的解释说pakt降解了 ...

miamian 请问哪位用ABI 7900做过等位基因分型？我们装的是SDS2.3软件，今天做等位基因分型，可是最后图谱那里没有图出来，结果无法判断，是不是设置错误了呢？我看的ABI 7900说明书，说明书上关于等位基因分型（AD）其中有一步是“create marker”，再“create detector”，可我设置完cmarker后，就软件上没有发现“ceate detector”，所以我没有另外设置detector，只是在PCR扩增 ...

d调华丽 求大肠杆菌 lpp（脂蛋白）启动子的序列~谢谢吴佰霖 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/946175下载基因组fasta序列，计算lpp在里面的位置d调华丽 吴佰霖 wrote:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/946175下载基因组fasta序列，计算lpp在里面的位置怎么计算？本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师 ...

huaxiflame05 各位，我的实验最近遇到了问题，检测一个趋化因子，Western 重复性很差，只有蛋白上样量接近200ug的时候才能勉勉强强看到很弱的条带，并且杂带很多。师兄建议让公司合成纯化蛋白。但问题是原核表达的蛋白分子量35kDa，在真核系统里，这个蛋白质高度糖基化，分子量可达到60kD。在这种情况下，如何构建阳性对照呢？**解答magichunter 换成单克隆抗体应该特异性更好些。另外，你不能用与实验动物相 ...

紫叶竹韵 做IP，之后Western 分析，看到有两条带，在25和50KD左右，应该是抗体的两条带，但是我的目的蛋白也是52KD的，这该怎么区分呢。woxingwosu 最好是选择与做IP不同来源的抗体来做（比如说IP用鼠的抗体，WB就用兔的抗体），这样就不会检测到抗体的两条带。如果没有不同来源的抗体的话，就要做IP的时候尽量少放点抗体，跑胶跑得远一点，使得目的蛋白能够被看到，不过由于你的蛋白是在是太接近重链了，要分开难度还 ...

winniw214 同样的菌液，用来提蛋白的。因为摇床问题，今天先摇了一半，离心后-80度冻存。另一半正在摇，准备明天离心冻存的。但是发现明天没有离心瓶了。由于是冻菌，不方便借别人的离心瓶。我是想可不可以将现在冻着菌的瓶子拿出来离，反正菌是一样的。但是我介意的是离心是4度，菌液冻存后从-80到4度，又累积了新的菌后又存-80，这样可以吗？紧急提问啊，在线等,谢谢！dnazyme 如果是哺乳动物肯定很多细胞死掉了.大肠也许坚强一些 ...

lilililiwoody 比如我查的资料D-丝氨酸的分子量是105.09，白介素-1的分子量是17KD，载脂蛋白E的分子量是34145D，它们的单位不同，我怎么比较它们的分子量大小？谢谢各位大侠，**了！woxingwosu D：daltonKD: kilodoltons, = 1000 D,是D的一千倍lilililiwoody 谢谢版主！本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙 ...

familar 小妹困惑，在此请教大师！做了几次beta-catenin的表达（western），都没做出来，目的蛋白的分子量是92，可是，做出来的印记总是在下方，明显的不是目的蛋白的位置。我师兄说，做beta-catenin要提核蛋白才能做出来，可我之前也有做出来过的！请教各位有经验的同志，这样的现象是何解？woxingwosu 不一定要提核蛋白才能出来。b-catenin在核内核外都有分布。应该是你实验过程中的问题。每次 ...