蛋白质技术

前言阿尔茨海默症（AD）是痴呆症的代表性疾病，病理学特征表现为伴随神经细胞脱落的大脑皮质萎缩，还有出现老年斑（以淀粉样蛋白β肽（Aβ）为主要成分）和神经原纤维变化（以过磷酸化tau蛋白为主要成分）。这两种病理图像是由于蛋白质聚合而成的β折叠平行重叠成交叉β折叠结构，即形成“淀粉样蛋白结构”而成。为了进行研究，人们研发出能特异性、选择性地结合Aβ或者tau蛋白形成的β折叠结构的低分子化合物，而这些化合物还需要具有血脑 ...

一、蛋白样品的制备与定量（提取好的蛋白是成功的一半）（1）提细胞蛋白① 消化或刮下细胞至1.5的EP管中，标记，10000r离心2min，PBS洗2-3遍。② 尽量吸去EP管中PBS，加适量RIPA裂解液（RIPA裂解液+蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联装）。③ 冰上裂解30min~1h，开4°离心机。④ 4°离心11000r，20min。⑤ 取上清，测蛋白浓度，加蛋白上清的四分之一体积5x上样loading buffer，煮沸（95℃加热5min），分装。（2） ...

Rapid mixing accessories to perform stopped flow measurements have found application in characterising interactions and reactions occurring in solution. Reactants are expelled from syringes, mixed and injected into a flowcell. The flow is then stopped with the ensuing reaction / i ...

大阪大学蛋白质研究所藤井勇树、高木淳一东北大学大学院医学系研究科金子美华、加藤幸成前言在分析蛋白质的功能时最重要的是如何得到高纯度的蛋白。现今提纯蛋白最常用的方法是亲和标签系统。被统称为「Epitope Tag」的肽标签以及其单克隆抗体组成的系统有FLAG、HA、Myc等多种标签。但是，每个标签系统都有优缺点，并不存在完美的标签系统。于是，在克服了众多难关后我们终于开发出有超高亲和性的新型亲和标签系统“PA Tag Sys ...

师兄发现，最近做 WB 的小伙伴真的不少，为了解决一些小伙伴在WB上遇到困难，师兄专门跑去坛子里，把一些有关 WB 的好贴扒拉出来，供你们不时之需，同时也要感谢下我们无私的战友 lee800265。那么今天我们就从SDS-GAGE失败案例开始吧。想了解更多实验方法和技巧的同学，可以向我申请微信好友哦，我的微信号：shixiongcoming 。向我申请的时候一定要记得备注你的目的，要不然我可会拒绝你哦。SDS-PAGE “hall of shame ...

PFGE技术简介：1984年Schwartz和Cantor发明了交变PFGE技术，解决了大片段DNA （＞40 kb）差异的问题，同时提高了DNA的分辨力。此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级DNA的能力。这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。工作原理：大小不同的DNA 分子在交替变换方向的电场中做出反应所需的时间不同，一般较小的分子重新定向较快，在凝胶中移 ...

1 背景和意义从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病理研究）已成为研究生命科学的主要手段。而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。基于 ...

Q：SWATH技术的原理是什么？我为什么要做SWATH？A：SWATH采集模式是一种新型的MS/MS扫描技术，将扫描范围划分为以25Dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息，是MS/MSALL技术的扩展。SWATH技术可以用于蛋白质定量或蛋白复合体的鉴定。SWATH定量方法基于提取Transition峰面积计算出肽段含量，通过肽段含量推理出蛋白质含量。SWATH定量 ...

一、SWATH技术简介SWATH（Sequential WindowAcquisition of all Theoretical fragment ions）是瑞士苏黎世联邦理工学院的RuediAebersold 博士及其团队与AB-SCIEX于2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术，是MS/MSALL技术的一种扩展。以蛋白质组学样品分析中常见的扫描范围400 ～1200 为例，每25 Dalton 作为一个扫描间隔SWATH），每个SWATH ...

蛋白质组（proteome）一词是澳大利亚科学家Williams和Wilkins于1994年首先提出的，它是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质总和，是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体。短短20年间，蛋白质组的研究取得了惊人的进展，这相当程度上要归功于质谱技术在蛋白质组中的应用和不断发展。同时，蛋白质组和基因组的发展是相辅相成的，凡是经过基因组测序的物种，都可以用质谱技术大规模鉴定其蛋白质组成。 ...

接上一期 SDS-PAGE失败实例及分析第四期—— 条带仅在凝胶顶部，本期就来讲讲由于条带仅在凝胶顶部，而在产生的问题扭曲的条带有这个问题的凝胶在整个“失误大全”中到处可见。这是由于分离胶的表面不平所造成的，因此当样品浓缩之后所有的条带都变扭曲的形状。扭曲的条带也可以见于电场的不均一，但是这种条带的扭曲应该是对称的。加样孔不成形当样品溢出至邻近加样孔，你就会观察到横贯几个孔的连续的蛋白条带（箭头所示）。事实上，这种情况通 ...

接上一期 SDS-PAGE失败实例及分析 前端指示剂缺失，本期就来讲讲由于条带仅在凝胶顶部，而在产生的问题过早终止电泳——例1很明显这块胶的指示剂前端位于什么位置。仍有继续电泳的空间可以把条带分得更开以增加分辨率。相对迁移率是为了分析凝胶相同位置上相同大小的蛋白。随着蛋白迁移距离的增加分辨率逐渐增高直到弥散限制了分辨率的继续提高。过早终止电泳——例2这两块胶一个是7%的一个是14%的，看起来都还不错。有些人做实验室很不 ...

接上一期 SDS-PAGE失败实例及分析 之 条带过浅，本期就来讲讲由于前端指示剂缺失，而在产生的问题部分前端指示剂——例1为了装置凝胶花了不少功夫，如果停止电泳太晚就太可惜了。因为如果部分前端的指示剂已经跑出凝胶的话就不能确定各个条带相对应的迁移率了。这块胶有一个内部的刻度——也就是跑胶时带上了分子量标准（Marker）。由于条带较平直，任意条带都可以作为参考来确定跑胶的迁移率。前端指示剂缺失——例2这块胶跑胶时间过长以至 ...

接上一期：一、症状——条纹拖尾条纹拖尾——例1这块胶就非常难看了。原因在于分离胶倒完之后没有用水或者异丙醇压胶，导致分离叫上缘非常粗燥，就像你看到的一样。当样品堆积在凹凸不平的分界线时，位于凹陷部位的蛋白由于不能适当的浓缩就析出来了。然后再跑胶过程中逐渐溶解造成了条纹拖尾症状。二、症状——条带过浅条带过浅——例1这个问题可能是由于加样孔成形不佳和/或凝胶加样不认真所致。背景较深而且不均一说明蛋白可能存在于电泳缓冲液中 ...

SDS-PAGE “hall of shame”如果你能够非常熟练的制备一块完美的凝胶，甚至对它进行改进都十分困难，那么你真的应该值得庆幸！但是如果你不能达到这个水平也不要灰心。所有的优秀的科学家都是从失败中成长起来的，事实上，如果不出错我们就很难学到更多的东西！（我的western blot技术也是从上百次的失败中成熟起来的，这中间我就学到了很多，相对于PCR，我第一次就成功的做出了RT-PCR和重叠延伸PCR，但是对于PC ...

一、关于CCD相机的另一些指标：拍摄凝胶的专业CCD相机要用单色的。不能用彩色的。CCD相机的象素基本上都在一百万多一点。拍摄的照片像素就是1000 X 1000多一点。好的CCD相机能拍摄12位深度甚至16位深度的灰度图片。这是拍摄弱光样品所必需的。冷CCD拍摄弱光样品时感光度更高。像化学发光膜这种弱光，最好用低于环境温度20度的冷CCD拍摄。拍摄凝胶照片有什么技巧？有。第一个注意事项是要把样品图片拍摄得尽可能大。让 ...

无论是DNA电泳图片还是RNA电泳图片，或者是蛋白的凝胶电泳图片包括Western blot膜、或者是化学发光膜图片，在图像分析的角度来看，都是同样的一种条带光密度分析的问题。分析电泳条带有专门的一类图像分析软件。常见的是Bandscan, Quantity One, 由各个凝胶电泳成像系统厂商自己编制的软件就更多了。我喜欢用的是Labworks, 是UVP公司生产的凝胶电泳成像系统上配用的拍摄与分析软件，实际上就是传说中大名 ...

药物潜在靶标的识别对于早期药物分子的研发、安全性评价和老药新用等领域都有着非常重要的意义，但是受制于通量、精度和费用的影响，实验手段的应用难以广泛开展。作为一种快速而低成本的手段，计算机辅助的靶标识别算法的开发正在受到越来越多的重视，发展快速、精确的靶标识别预测方法对于靶向性药物开发、药物-靶标相互作用网络图谱的构建和小分子调控网络的分析都具有十分重要的意义。目前，通过计算机辅助进行反向找靶主要有三种方法：反 ...

一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细 ...

高斯建模与结果分析：a.高斯建模，即用数学方法（微积分）对正态分布曲线进行统计分析。理论上每道band的光密度都呈正态分布的平滑曲线（每个band中间位置蛋白压缩最紧浓度最高，向上向下因扩散而减弱）；然而实际操作过程中，如果荧光过强，往往出现类似方波的曲线（曲线无peak峰，上方为平滑直线，超识别的最高阈值）；荧光较弱宜出现波浪样（多）波峰，或难与背景区分。首先电脑会统计band中每个点的光密度值，并对这些值按正态分布 ...