阿尔茨海默症患者脑切片 检测老年斑神经原纤维变化

前言

阿尔茨海默症（AD）是痴呆症的代表性疾病，病理学特征表现为伴随神经细胞脱落的大脑皮质萎缩，还有出现老年斑（以淀粉样蛋白β肽（Aβ）为主要成分）和神经原纤维变化（以过磷酸化tau蛋白为主要成分）。

这两种病理图像是由于蛋白质聚合而成的β折叠平行重叠成交叉β折叠结构，即形成“淀粉样蛋白结构”而成。为了进行研究，人们研发出能特异性、选择性地结合Aβ或者tau蛋白形成的β折叠结构的低分子化合物，而这些化合物还需要具有血脑屏障通透性。

我们对这些化合物用发射正电子的放射性核素C-11 和F-18 标记，再作为药物来治疗AD患者，之后通过正电子断层摄影装置摄影，得到以前死后解剖才能看到的局部大脑病理学图像（Aβ、tau）。

笔者等人在开发PET探针的过程中尝试了各种各样的化合物，与β折叠结构结合的化合物具有平面性，其中很多都具有荧光性。迄今为止，研究人员都一直在开发对老年斑选择性比较高的BF-1681）化合物和对神经原纤维变化选择性比较高的BF-1702）化合物。

而这篇文章将会介绍无需使用放射线，在基础研究中呈现染色性、荧光性特征的BF-187、BF-188化合物。

BF-187和BF-188的特点

BF-187、BF-188和前面所说的BF-168、BF-170一样，是能够识别由Aβ或者tau蛋白形成的β折叠结构的化合物。用以上这些化合物染色石蜡包埋AD患者的脑切片，BF-168选择性识别染色老年斑，BF-170选择性识别染色神经元纤维变化。而BF-187、BF-188则可以清晰地染色两种病理图像。

尤其是BF-188，笔者等人发现使用一般荧光显微镜（Nikon ECLIPSE 80i）的滤光器（激发波长：400-440 nm，荧光波长：470 nm～）能够观察到，老人斑（Aβ）染成了绿色，神经原纤维变化（tau蛋白）由黄色染成了橙色。

不仅如此，使用UV-1A滤光器（激发波长：360-370 nm, 荧光波长：400 nm～）或者V-2A滤光器（激发波长：380-420 nm, 荧光波长：450 nm～）能够观察到，只有老人斑有选择性地从蓝色染成蓝绿色。

另一方面，使用B-2A滤光器 （激发波长：450-490nm, 荧光波长：520 nm ～）或者G-2A滤光器（激发波长：510-560nm, 荧光波长：590 nm～）来观察，能够发现神经原纤维变化有选择性地从橙色染成红色。这就体现了BF-188具有波长选择性3）的特征。

tau的病理图像中除了有神经原纤维变化，还有神经纤维网线、神经斑块的变性突出（局部存在于Aβ周围的tau病变）。

BF-188能够清晰地用颜色区分含有tau病变的老年斑。虽然通过BV-2A 、B-2A滤光器，使用BF-187也能够清晰观察到两种病理图像，但它并没有BF-188的波长选择性特征。

而且使用多光谱CCD 相机Nuance ®（Perkin Elmer）和BV-2A来摄影观察BF-188染色的AD患者脑切片，能够发现老年斑的荧光光谱和神经原纤维变化的荧光光谱有着很大的差别。

因此可以知道，使用光谱图像技术，在去掉自体荧光的同时，能够分离老年斑信号和神经原纤维变化信号，并高S/N 比率地一次性评价两种病理图像。这意味着仅用BF-188染色就可以分别定量地评价老年斑和神经原纤维变化两种病理图像。

把近红外线区的色素（Cy5.5、Cy7等）用于第二抗体的话，Aβ・tau病变使用BF-188染色，目标蛋白质就能够进行使用抗体的免疫染色来实现多重染色。

正如上述所说，这些化合物能够识别病理图像中蛋白质形成的β折叠结构，与平常抗体识别的氨基酸序列也就是“抗原表位的识别”不同。特别是在tau病变方面，存在有神经纤维缠结前状态、胞内缠结，胞外缠结（遗留缠结）几个种类的神经原纤维变化，所以聚合的结构、曝光的抗原表位也不一样。

这意味着使用β折叠化合物和使用抗体的免疫染色有不一致的地方。例如，遗留缠结几乎不被AT8的tau蛋白的磷酸化抗体（抗原表位：pSer202/Thr205）染色，但遗留缠结都会被目前为止的化合物清晰染色。

另一方面，不含AT8染色的聚合纤维的神经纤维缠结前状态没有被染色。由此可得知，抗体、低分子化合物识别的方式不一样，我们在解释实验结果前需要明白，实验结果不可能达到100%一致。

那么，为什么BF-188与老年斑、神经纤维原变化结合时能够体现不同的荧光特性呢？这两种病理图像的主要成分Aβ、tau蛋白的共通点是含有β折叠结构。而不同点在哪里呢？其中一点是神经原纤维变化里的tau蛋白过度磷酸化。

我们对BF-188使用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，研究其染色性，但是染色性在去磷酸化处理前后并没有什么不同，由此可知磷酸基在BF-188中几乎没有发挥任何作用。通过以上的研究得出，Aβ、tau蛋白虽然都有β折叠结构，但是其结构有微妙的差异，和低分子化合物间的相互作用也有不同。

这次重新验证了近年来实现了临床活体图像化的tau选择性PET探针4, 5）。BF-187、BF-188是能够识别β折叠结构的低分子化合物，但对Aβ、tau蛋白的结合亲和性不同，有选择性结合tau病变的性质5, 6）。

BF-187、BF-188的染色步骤和观察方法

一般来说，BF-187、BF-188的染色步骤是一样的。

①对石蜡脑切片进行去石蜡处理。

②用100%乙醇溶解BF-187、BF-188使终浓度成200μM。

③用纯净水稀释，调制成100μM化合物溶液。

④把化合物溶液滴到切片上。

⑤反应10分钟，用PBS洗净。

⑥用防止荧光褪色剂密封。

⑦使用荧光显微镜观察，拍摄照片。

~undefined进行有免疫染色的多重染色时，如有必要，可用高压灭菌器进行抗原活性化处理，免疫染色后再对化合物进行染色，从而能够实现多重染色。但是，使用甲酸处理会破坏识别化合物的β折叠结构，导致化合物染色的脱色，请多加注意。

虽然也可以在染色化合物后再进行免疫染色，但是这样化合物染色的对比度有可能下降，所以笔者等人选择先进行免疫染色。另外，如有必要，使用自体荧光淬火处理（脂褐素处理）可减弱背景的自体荧光。

BF-187和BF-188的应用

BF-187、BF-188 和BF-168、BF-170一样具有高血脑屏障通透性。因此，荧光化合物BF-187、BF-188能够应用于临床前研究的双光子激发显微镜In vivo成像。但是，由于没有使用转基因小鼠等动物模型进行过相关深入研究，关于小鼠的老年斑、神经原纤维变化的结合性、波长选择性方面的资料暂时还不明了。

结语

与免疫染色相比，使用化合物的荧光染色操作更加简单。使用这些化合物，特别是使用本文介绍的BF-188能够一次性用颜色区分老年斑和神经原纤维变化。我们期待这些化合物应用于动物模型的临床前研究，并成为分析Aβ和tau蛋白的实时时间过程以及他们间的相互作用的有用工具。

〔参考文献〕
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２）Okamura, N. et al . : “Quinoline and benzimidazole derivatives : candidate probes
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３）Harada, R. et al . : “Use of a benzimidazole derivative BF-188 in fluorescence multispectral imaging for selective visualization of tau protein fibrils in the Alzheimer's

disease brain.”, Mol. Imaging Biol ., 16, 19-27（2014）.

４）O kamura, N. et al . “: Non-invasive assessment of Alzheimer's disease neurofibrillary
pathology using 18F-THK5105 PET.”, Brain, 137, 1762-1771（2014）.

５）Okamura, N. et al . : “Tau PET imaging in Alzheimer's disease.”. Curr. Neurol. Neurosci.

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６）Harada, R. et al . :“Comparison of the binding characteristics of [18F]THK-523 and other amyloid imaging tracers to Alzheimer's disease pathology.”, Eur. J. Nucl. Med. Mol.

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