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【资源】WESTERN BLOTTING心得

做了五个月的WB,有一点点小心得,给新手点经验.蛋白提取:1.总蛋白提取(胞膜,胞浆,胞核):组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加undefinedPBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存2.组织膜蛋白提取:所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml B ...

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【专题讨论】膜蛋白的分离

膜蛋白的种类繁多,约占总蛋白的30%,同时赋予细胞膜非常重要的生物学功能,但是由于其特殊的性质和结构特点,我们获得膜蛋白相比较其他蛋白来说要困难得多,因此如何获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要,本人曾经试图获得一肿瘤组织中的p-gp,也许是由于实验室条件的限制,费了九牛二虎之力也未能获得一个比较理想的结果,如果大家有什么好的分离膜蛋白的经验不妨贴出来,供大家一起分享,共同学习,共同进步。以下是我 ...

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【资源】常用试剂公司网址

最近需要购买试剂,人家介绍什么santa-cruz,BD,DAKO,newmark 公司,结果回来上网查找时 直接输入这些公司名字还是不能直接到达公司网站,四处搜搜,发现有些朋友提供了一些常用公司的网站,现贴出来一起分享,其他朋友继续补充。。。试剂公司网站毕龙—毕特博商务网http://www.bilong.com中国科学器材网http://www.sciequip.com.cn/鼎国生物http://www.dingguo.com/生 ...

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【原创】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 !

我上个月做了 mating (酵母双杂交的一种办法)。现在已经做到了,X-gal assay。从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。第二次 挑选出了74个蓝色克隆。可是,对比发现重复变蓝的只有 11个。What can I do for it NEXT~我的具体步骤是。一 :文库建立1. mammalian cell total RNA -- Poly A RNA -- dsRNA -- 提纯 dsRNA。2. 将提纯的dsRNA 转染到AH109细胞株,涂在 150ㅠ待 3~5天克隆出现 并长势饱满.3. 每个150ㅠ, 放入5ml fre ...

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[转贴]包涵体纯化复性

关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题,包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌?细胞的破碎方法1.高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2.玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再 ...

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【转帖】Western Blot 内参选择

版内常看到WB内参问题,看到一篇文章,觉得不错,转帖在此。http://blog.bioon.com/user3/23049/archives/2007/137682.shtmlWestern Blot 内参选择 作者:明日百傲要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然,顺 ...

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【转帖】对于多糖研究的一些看法(转至新语丝)

◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇  对于多糖研究的一些看法  天山童姥  (本文纯属学术争鸣,不针对某个人或者某个研究单位)  近几年来,多糖的研究很热门,尤其是各大院校的食品专业科研人员纷纷涉足于此领域,翻看一些国内食品科学杂志,基本上每期都有多糖的研究,有时甚至一期有好几篇。来源更是五花八门,真菌多糖,枸杞多糖,茶多糖,等等。对于多糖的研究,我有一些 ...

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【Jounal club】生命科学领域中的成像术

说是成像术,其实就是拍照,从最常规的简单的EB染色,CBB染色,到荧光成像,化学发光,再到最危险的同位素成像等,原理都是差不多,即条带和背景之间信号的差异,只是过程和要求不同而已从灵敏程度来划分常规染色 ug-ng级荧光 ng-pg级化学发光 pg级同位素 pg-fg级做科研过程中,如果没有其他因素的限制,每人都希望检测灵敏度越高越好,这样真实程度也就越高,越不容易出现漏检的情况,能决定科研项目是否有必要进行下去的可能等等,所以我 ...

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[资源] 双向电泳凝胶分析软件合集

版子上最近有好几位朋友提供了不错的双向电泳的凝胶分析软件手册等内容(感谢merlynhuang兄以及czlong2008兄),我把他们归纳一下,欢迎各位补充使用感受:)I. 软件与使用手册下载1. BIORAD公司出品PDQuest V7.3.1 下载PDQuest V7.3.1英文使用手册PDQuest中文讲义(感谢merlynhuang兄提供)2. Amersham公司出品ImageMaster V5.0版下载ImageMaster V5. ...

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【建议】关于如何提蛋白质纯化问题(附例)

在得不到足够信息的情况下,往往比较难以分析,大家多是在假定一些信息来回答问题,这样有时候碰巧符合了,但也有推断错误的时候。这样对解决问题是不利的。如果不涉及到技术保密问题,关于蛋白质纯化问题都建议按下列信息来提问。1、建议贴张SDS-PAGE图来分析一下,最好包括:Marker,胶浓度,变性还是非变性诱导前诱导后破菌上清破菌沉淀沉淀洗涤上清变性溶解上清变性溶解沉淀柱纯化前柱纯化穿透柱洗脱等各个样品。标上mark ...

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蛋白质的疏水层析纯化步骤---写给新手,请指正!

疏 水 层 析1、疏水层析是根据不同蛋白质的疏水力强弱不同来分离的。在高盐离子强度的情况下,蛋白质的疏水基团充分暴露与填料的疏水介质相互作用,从而结合在柱子上。不同蛋白质的疏水性强弱不同从而导致其与柱子填料的结合力也不同。随后,逐渐降低洗脱缓冲液的盐离子强度就可以将不同的蛋白分布洗脱下来,形成一个个的蛋白质洗脱峰。2、柱子的装填:如果是预装柱,就不存在装柱的问题了。不是,则从头开始:首先,把柱子洗干净,一定要洗干净,不然会出现 ...

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【专题讨论】蛋白常用lysis buffer组成与作用详谈

蛋白质技术中常常要用到lysis buffer,各个实验室的lysis buffer的配方是不同的,开设个专题,希望大家详细谈谈自己使用的lysis buffer的配方,以及各个组成成分的作用,方便广大蛋白质战友。先介绍一下我们用的:PBS缓冲液,不用多说;TRITON X-100Triton X-100中文名为曲拉通X-100,分子式为t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH, x=9-10,平均分子量为647。 常用的非离子性去垢剂,主要 ...

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【信息】PubMed医学文献检索指南

PubMed医学文献检索服务系统,其检索内容包含MedLine,PreMedline(不含Mesh检索主题词)医学文献数据库及其他电子出版文献。1.PubMed基本检索方式(Basic PubMed Search)进入PubMed基本检索方式主页,在检索框中可以输入任意词,包括文献作者,出版杂志等:键入一个或多个检索词(可以为任意词),如protein disulfide isomerase ,也可以输入缩略名如pdi等;输入多个词 ...

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[资源]【整理】蛋白版05年12月无人应助贴

整理了一下2005年12月份蛋白版的无人应助贴,以支持版主的工作已被锁、被扣分、标题为空以及不符合发贴格式的无人应助贴不在此列应助战友请到积分申诉区给出链接,谢谢哪位用过quantityone软件用quantityone软件进行WB的条带处理。哪位用过的朋友稍微讲讲啊http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4994642&sty=1&tpg=22&age=0 跨膜蛋白分析及做图软 ...

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【公告】蛋白版关于整顿版面的公告,请大家充分理解与支持!

为了方便战友,方便版面管理,经过蛋白技术讨论版几位主任协商一致决定于近期对蛋白技术讨论版版面进行整理,规范发贴,请大家在发贴求助或分享资料时注意以下几个方面:1 请您在发贴前务必对发贴内容在版内或丁香园进行全面搜索,检查是否已经有过类似内容的讨论,以免造成重复。对重复发帖,重复求助锁贴扣分处理,有特殊情况请pm本版主任 2 发贴时请规范发贴格式,对于标题,请在其前方选择相应的分类标记,如:【原创】、【转帖】、【求助】、【求购】、【建议】、 ...

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【原创】Western Blot经验总结

以前自己总结的Western Blot经验。原先看到版上WB资料泛滥,不想发了。但是后来想想存在电脑里也是浪费,还不如共享一下:)希望对大家有用!1、缓冲液的选择,是用PBS/PBST,还是用TBS/TBST?(1)PBS/PBST不适合AP系列,TBS/TBST适合AP和HRP体系。(2)另外,做磷酸化蛋白的WB,PBS不合适。2、如果用HRP体系,那么不能用叠氮钠做防腐剂。因为叠氮钠会抑制HRP的作用。3、WB中抗体的选择:单 ...

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【资源】【蛋白纯化旧贴整理】-蛋白纯化原理,问题回答!

蛋白纯化http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4774978_1.html 幻灯片http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1922610_1.html 原理图蛋白纯化网站(蛋白纯化方案均有详细PDF)http://www.dxy.cn/bbs/thread/7134009纯化后制备多抗及抗体蛋白保存http://www.dxy.cn/bbs/actio ...

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【原创】Western blotting细节——献给完全一个人做此实验的xdjm们

在正文开始之前,请允许小妹我简单介绍一下个人情况,顺带为即将独自一人做此实验的xdjm们打打气。小妹我上无师兄师姐(上届师姐于我开始做实验时已毕业),下无师弟师妹(下届师弟师妹尚未开学),由于种种原因被老板发配到外院一个生物治疗中心进行我的实验。在我开始做Western时,制胶器及转膜仪等均未开封,老师们均表示以前也未做过Western。所以我是第一个吃螃蟹的人,吃苦或许是注定的。我自己找了一个常做Wester ...

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【分享】质粒与载体

一、质粒绝大多数的生物都是以DNA的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication,或译为复制起点),使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon,我们姑且把它译为为复制体吧!。原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中质粒的基因体和原核染色体类似,是由双 ...

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【转帖】Western Blot 常见问题分析

转自http://www.51protocol.com/pro/WesternBlotting/20071031/38744.html1. 在western实验中,通常有人采用TBS,有人采用PBS,能否有人解释一下二者在使用中的区别?  选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS(因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围),TBS在PH7.0以下缓冲 ...

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