PCR技术

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在P ...

【整理】2006年01月01日 - 2006年02月30日两月来的无应答帖 希望各位战友积极应助 辛苦了！谢谢！by mybbff(求助)关于real time PCR 操作软件opticon 2http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=5328144&sty=1&tpg=33&age=0红细胞裂解液http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=5580426&sty=1&tpg=10&age ...

各位好！我是分子生物学实验的新手。我的课题的第一步是要用RT-PCR获得全长的cDNA（接到pMD-18上）,我用如下引物的话是不是无法得到所要的目的序列？因为primer5.0的评分很差的。各位好朋友能否帮帮我？Genebank Accession Number :AF144325gene:1...1758cds: 100....17311 aggagaaaag ggcgctgggg ctcggcggga ggaagtgcta gagctctcga ct ...

1．目的学会PCR操作的基本技术。2．原理是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中

Ambion公司的protocol:将合成的DNA(长度约55nt)溶解成1ug/ul,各取2ul,加46ul退火缓冲液(100mM乙酸钾，30mMHEPES-KOH pH7.4,2mM乙酸镁)，90度30min,37度1h,然后可以用来联接，或贮存于-20度。我们实验室有人按此方法成功了,我正在做。其他的非RNAi专用的退火条件有：TaKaRa:1.用STE缓冲液(10mM Tris pH8.0,50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解DNA ...

在分子生物学领域里摸爬滚打了两年多，在园子里也逛了一年多，没写过什么原创贴子，这算是第一个，只是浅显的经验，希望与大家交流、分享、共勉！！！我看到了很多帖子，大家在查找Gene序列的时候，有些战友总是弄不明白那个是自己想要的序列，因为在NCBI的GeneBank里面搜索以后，实在是有太多的序列出现，而且长短不一，名称各异，DNA，mRNA ……，有点让人眼花缭乱，下面就是我的一点小经验：通常大家都是在Nucleotide里 ...

Nature Protocols 3, - 1452 - 1456 (2008)Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplificationDarren J Korbie & John S MattickTouchdown (TD) PCR offers a simple and rapid means to optimize PCRs, increasing specificity, sensitivity and yield, without the need for leng ...

不知道大家做突变的时候都用什么方法。有经验的战友不妨来交流一下啊。说说我的先。由于本人没有这方面的经验，所以**求各位战友的意见和建议啊。大家多多批评指正。我要做一构建好的质粒上约100bp的片段的缺失，利用反向PCR的方法。以下是利用实验室现有资源的实验设计：1 Phosphorylation of the 5’-end of a primer10×kinase buffer 2ulprimer (20uM) 5ul10mM ATP 2ulpolynucleo ...

坑爹啊，一个载体构建，花了我四个月时间，往事不堪回首，为了各位兄弟姐妹们避免重蹈我的覆辙，我就一把鼻涕一把泪的给大家倾诉一下。构建之前啊，我就翻丁香园啊，把里面关于载体构建的精华看了一遍啊，然后呢，以为构建载体很简单啊，以为一个月能搞定啊，所以满心欢喜的就开工了啊。实验室没有载体，就跟别人借。载体借到了，按照文献里报道的选了两个酶切位点，离的太近，先单酶切验证，一切正常。接着往地下做，为了省时间，选用PCR产物直接双酶 ...

PCR/RT-PCR疑难问题解答（一）［ 作者：佚名 转贴自：210.83.8.237 点击数：23 文章录入：kay76 ］一、问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因：1．RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否 ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

PCR 引物设计及软件使用技巧自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物 ...

近日因实验需要，搜索了园中关于高GC含量PCR相关的资料，顺便整理了一下，做一个资源链接小结，以方便需要的战友查阅；也欢迎有体会的战友提供实战经验！===============================高GC含量的PCR应注意什么?【求助】高GC含量片段扩增问题如何解决【求助】高GC含量的基因PCR应注意什么？高GC含量PCR困难，求助求助：高GC含量PCR的扩增【求助】5'高GC含量的pcr怎么做啊【讨论】PCR一定要加DMSO吗?【求助 ...

我的题目是鸡Mx基因的克隆，我的策略是先根据该基因家族(dynamin family)的氨基酸保守区设计简并引物克隆出该基因cDNA的部分片段，然后根据该片段序列设计基因特异性引物，利用RACE技术得到cDNA的3‘和5’末端，然后根据末端序列设计引物扩增出该基因全长cDNA.我用简并引物从鸡cDNA中扩增出一个片段，约250bp, 测序后拿来BLAST时却发现，与之同源性最高的并不是其它的Mx基因，而是人的某一个基因 ...

原文链接：http://genloci.biomart.cn/news/134612.htm●?我们有专业的团队以凌建群博士（基因重组操作系统IOS技术发明者，曾任美国斯坦福大学医学院资深研究员和实验室主任）为研发核心，来自美国斯坦福大学、丹麦哥本哈根大学、北京大学、浙江大学、南京大学、厦门大学，东南大学等国内外知名院校的优秀学子加盟。● 我们有成熟的技术平台、齐全的实验设备吉锐生物为您提供完整的基因敲除解决方 ...

Mutation SurveyorMutation Surveyor 是美国Softgenetics公司和中国华生恒业科技有限公司联合开发的Mutation/SNP检测软件，用来实现高通量(high-throughput)，高灵敏度(sensitivity)和准确率(accuracy)的DNA突变/SNP检测，目前已被全世界数百家知名机构使用(国外著名专家对Mutation Surveyor的评价和意见)，在不到一年的时间内，分 ...

核酸蛋白检测仪、紫外检测仪是检测核酸蛋白质的重要工具。以下是说明书的内容。检 测 仪 使 用 说 明 书一．概述　 核酸蛋白检测仪、紫外检测仪是液湘色谱仪中的一种紫外检测装置，核酸蛋白检测仪、紫外检测仪是根据生命科学的发展对于现代色谱仪器的要求而改进设计的一种新型紫外检测仪。该仪器在创新方面的主要特点为：1. 该仪器除配有输出10ｍV记录仪信号外，还配有输出适合计算机积分仪的输口，这样很方便构成色谱工作站系统。（可同时进行计算机和记录仪信号输出，亦 ...

PCR 引物设计及软件使用技巧张新宇，朱有康，高燕宁（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编 ...

PCR问题的总结pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变 ...

一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌 ...