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        【交流】反向PCR法构建缺失突变

        丁香园论坛

        3561
        不知道大家做突变的时候都用什么方法。有经验的战友不妨来交流一下啊。说说我的先。由于本人没有这方面的经验,所以**求各位战友的意见和建议啊。大家多多批评指正。
        我要做一构建好的质粒上约100bp的片段的缺失,利用反向PCR的方法。以下是利用实验室现有资源的实验设计:
        1 Phosphorylation of the 5’-end of a primer

        10×kinase buffer 2ul
        primer (20uM) 5ul
        10mM ATP 2ul
        polynucleotide kinase 1ul
        dH2O 10ul
        Total volume 20ul
        37℃ for 30min .Heating to 90℃for 5min .-20℃for later use.

        2 Amplification

        dH2O 14ul
        10×Ex Bufffer 2ul
        dNTPs(10mM) 1ul
        Kinased Primer1(5uM) 1ul
        Kinased Primer2(5uM) 1ul
        Plasmid (0.1-1ng/ul) 1ul
        Ex Taq 0.25ul
        Total Volume 20ul

        94℃ 2min
        94℃ 45 sec
        68℃ 10min

        3 End-polishing PCR products with pfu

        PCR product 15ul
        Pfu (2U/ul) 3ul
        dH2O 12ul
        30 min at 72℃

        4 Purification by Recovery kit

        5 Ligation

        10×T4 DNA ligase buffer 1ul
        T4 DNA ligase 1ul
        Purified PCR(4ng/ul) 8ul
        Total volume 10ul
        20-25℃ for 5hr

        6 Transformation
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