【资源】实验四 PCR扩增制备目的基因
丁香园论坛
5006
1．目的
学会PCR操作的基本技术。
2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。
4．试剂
5U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。
5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Sense primer 5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇
Antisense primer ５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇
目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。
待扩增的CHI片段长度：996bp。
6．操作步骤
（1）在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
ddH2O 32μl
10×PCR buffer（不含MgCl2） 5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 2μl（12.5~25pmoles）
10μmol/L primer2 2μl（12.5~25pmoles）
模板质粒 1μl（1×10-3pmoles）
5U/μl Taq酶 1μl（5U）
总体积 50μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
① 94℃ 5min
② 94℃ 1min
③ 54℃ 1min
④ 72℃ 1min50s
⑤ goto② 29 times
⑥ 72℃ 10min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。
7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
学会PCR操作的基本技术。
2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。
4．试剂
5U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。
5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Sense primer 5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇
Antisense primer ５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇
目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。
待扩增的CHI片段长度：996bp。
6．操作步骤
（1）在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
ddH2O 32μl
10×PCR buffer（不含MgCl2） 5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 2μl（12.5~25pmoles）
10μmol/L primer2 2μl（12.5~25pmoles）
模板质粒 1μl（1×10-3pmoles）
5U/μl Taq酶 1μl（5U）
总体积 50μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
① 94℃ 5min
② 94℃ 1min
③ 54℃ 1min
④ 72℃ 1min50s
⑤ goto② 29 times
⑥ 72℃ 10min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。
7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
