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        【资源】实验四 PCR扩增制备目的基因

        丁香园论坛

        4992
        1.目的
        学会PCR操作的基本技术。
        2.原理
        是将待扩增的DNA模板加热变性,与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性,然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环,n次循环后DNA可被扩增(1+X)n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2(A+T)+4(G+C)。
        3.器材
        旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,0.2ml PCR微量管,双面微量离心管架,PCR仪,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,水漂,恒温水浴。
        4.试剂
        5U/μl Taq DNA聚合酶,PCR缓冲液(10×,MgCl2 free),25mM MgCl2,dNTP,引物,模板质粒pBS-CHI,无菌ddH2O。
        5.实验准备
        dNTP混合液(每种25mM),TAE电泳缓冲液,荧光染料,10´加样缓冲液,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。合成的引物:Sense primer 5'-GGATCCACAATGATGAGAGCC-3'

        Antisense primer 5'-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-3'

        目的基因模板质粒:已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶(chitinase,CHI)基因。
        待扩增的CHI片段长度:996bp。
        6.操作步骤
        (1)在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。(以下加样量供参考,括号内是最终需要量,实验时需参照Taq酶说明书计算)

        ddH2O 32μl
        10×PCR buffer(不含MgCl2) 5μl
        25mM MgCl2 3μl
        2.5mmol/L dNTP 4μl(每种dNTP终浓度0.2mM)
        10μmol/L Primer1 2μl(12.5~25pmoles)
        10μmol/L primer2 2μl(12.5~25pmoles)
        模板质粒 1μl(1×10-3pmoles)
        5U/μl Taq酶 1μl(5U)
        总体积 50μl
        (2)根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序:
        ① 94℃ 5min
        ② 94℃ 1min
        ③ 54℃ 1min
        ④ 72℃ 1min50s
        ⑤ goto② 29 times
        ⑥ 72℃ 10min
        (3)PCR结束后,取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
        (4)清理桌面,撰写实验报告。
        (5)PCR产物可以直接与T载体连接(见实验五),然后转化感受态细胞(见实验八)。
        7.思考
        (1)复性温度如何确定?
        (2)为什么要在最后延伸10min?
        (3)是否有非特异性扩增产物(或引物二聚体),如何才能消除?
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