PCR技术

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR与荧光定量P ...

一、分子生物学Promega:Promega公司是分子生物学研究工具的经典品牌，已有接近30年的历史，是生命科学这个朝阳产业中的“老字号”。该公司所特有的萤光素酶生物发光技术，灵敏度高，信号/背景比率低，在基础研究和药物筛选领域内得到广泛的应用和认可。应用范围涉及报告基因检测；细胞学活力、细胞毒作用、细胞凋亡检测；蛋白酶、蛋白激酶、核受体检测，以及描述药物先导物的吸收、分布、代谢、排泄等特征性参数的一系列检测方法。Pr ...

Routine PCR? Let’s be honest, there’s no such thing. Even with the simplest PCR reaction things can go wrong, so you need to have a good checklist of ideas for troubleshooting and rectifying the problem. Today I have brainstormed all of the ways I can think of to approach problems with standard PCR reactions. ...

pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引 ...

希望战友们积极参与，加分从优！求助变性胶的电压求助LD-PCR的原理、应用、特点求助引物设计分析如何计算hardy-Weinberg平衡的理论值 ？可以用spss软件计算吗？求助NaI提取核酸对PCR的影响做PCR过程中有谁听说过或遇到过气溶胶污染吗? 哪个质粒可以做mRNA 稳定性的测定，可以实现定向连接?外周血抽提RNA是否有时间限制？ 用限制性内切酶切片段序列是不是要比环状的载体难得多？帮助分析电泳图求助RT-PCR的 ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

对琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳有非常详细的介绍,对于刚接触分生大的同志很有帮助.PCR扩增产物的电泳分析　　凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳:　　琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片 ...

我初次接触PCR，准备做转基因后体内表到的半定量RT-PCR。用primer和oligo设计了一对引物，在primer上二个引物都打了100分，产物98分。但是有人说软件设计的引物有时候得分很高也会做不出来，所以想请各位高手帮忙看一下。:)我对这对引物有两个疑问：1 下游引物以AAT结尾是否不太好？2 产物长度是213，是否太短了，跑胶不好看？Selected Primers-------------------------------------------------- ...

－－PCR/RT-PCR疑难问题解答1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因：1）RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加 ...

基因序列cds，引物，目的片段如下：atggggacgccgggggaggggctg301 ggccgctgctcccatgccctgatccggggagtcccagagagcctggcgtcgggggaaggt361 gcgggggctggccttcccgctctggatctggccaaagctcaaagggagcacggggtgctg421 ggaggtaaactgaggcaacgactggggctacag ...

Protocol for competitive RT-PCRFor quantifying mRNA, we use a competitive RT-PCR protocol with internal standard RNAs. These are added in a defined quantity to the RNA sample prior to the RT reaction. The resulting standard cDNA is coamplified with the same primers as the endogenous target seq ...

数据分析excel地址http://d.dxy.cn/detail/4503890△△Ct法的推导过程PCR指数扩增公式是：Xn = X0 * ( 1 + Ex )n 式中，Xn是第 n 个循环后目标分子数，Xo 是初始目标分子数，Ex是目标分子扩增效率，n 是循环数。用Ct 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，因此：Xt = X0 * ( 1 + Ex )Ctx 式中，Xt 是目标分子X达到设定的阈值时的分子数，是一个常数。Ctx 是目标分子X扩增达到阈值时（即达到规定的拷贝数时）的循环数。对于看家基因的P ...

以下是在我查的因物设计要注意的一些问题，和大家共享PCR引物设计的黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为 ...

我想根据keratin基因（有30多个亚型）的共有保守序列，设计引物扩增，那位大侠能帮我找一下好吗？谢谢！keratin 5atgtctc gccagtcaag181 tgtgtccttc cggagcgggg gcagtcgtag cttcagcacc gcctctgcca tcaccccgtc241 tgtctcccgc accagcttca cctccgtgtc ccggtccggg ggtggcggtg gtggtggctt301 cggcagggtc ag ...

Primer Premier 4.10Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。这里我们主要介绍其引物 ...

邹承鲁院士写他是如何读文献的无论题目从何而来，都必需紧密追踪当前有关科学领域发展的动向。从研究生时代开始，在导师 教导下，以周围同学为榜样，我就养成了每周必定去图书馆浏览最新期刊的习惯，几十年如一日，雷打不动。如果确实有事，下周必定补上。我当时有一个小记录册，登录所有对本专业重要的刊物，每期读过后，一定做记录，决不遗漏一期，直至今日。现在可以在网上阅读所有重要刊物的目录和摘要，这就更容易做到了。掌握文献、对文献进行综合， ...

应助后请PM求助者！【求助】相同条件下，模板稀释后扩增不出来目标条带http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=6324633&sty=1&tpg=11&age=0请问同一种属不同品系的同一基因的MRNA相同吗http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=6328875&sty=1&tpg=10&age=0【求助】请教真菌中RT-PCR的内参http://www.d ...

各位老师：您们好！偶欲做几个基因的RT-PCR实验。偶先用传统的半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)扩增了几个基因，并用该试剂盒反转录了不少cDNA。但还有2个基因偶打算用real time PCR法来扩增。拟采用TaKaRa DRR041S试剂盒。但是TaKaRa DRR041S试剂盒说明书上写的反转录步骤是使用另外一个单独的RT Reagents (TaKaRa DRR033A)，得到cDNA再用TaKaRa DR ...

这里，很多经常遇到的问题，比如引物设计，PCR体系和条件，电泳条带分析等，我没有一一详细列举，因为这些原因比较容易找到，我这里列举的可能多是些容易忽略的疑难杂症，希望对大家有帮助。（说了是疑难杂症了，可能有一些看法走极端了，但是为了做出实验，怀疑一切，狗急跳墙，没事找抽也是值得的）。1.引物设计引物的参数合理控制，像发卡结构，错配，二聚体等，只要别太过分，问题应该不大，当然没有最好，个人感觉上下游两条引物的退火温度这个参 ...

PCR常见问题总结PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸 ...