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        请教real time PCR的RT部分能否使用传统半定量RT-PCR试剂盒的反转录部分?

        丁香园论坛

        2274
        各位老师:
        您们好!偶欲做几个基因的RT-PCR实验。偶先用传统的半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)扩增了几个基因,并用该试剂盒反转录了不少cDNA。但还有2个基因偶打算用real time PCR法来扩增。拟采用TaKaRa DRR041S试剂盒。但是TaKaRa DRR041S试剂盒说明书上写的反转录步骤是使用另外一个单独的RT Reagents (TaKaRa DRR033A),得到cDNA再用TaKaRa DRR041S试剂盒扩增。但是仅一个RT Reagents (TaKaRa DRR033A)就要1500元,请问能否将半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)制作的cDNA液体体系用于TaKaRa DRR041S试剂盒的real time扩增?因为这两种反转录体系有所不同(包括镁离子、dNTP等的量),得到的cDNA液体中各种物质的含量也会有所不同。这样套用不知行不行?两种反转录体系如下:
        DRR019A的RT配方  使用量(ul)  DRR033A的RT配方  使用量(ul)
        MgCl2  2    
        10×RT Buffer  1  5×M-MLV Buffer  2
        dNTP (各10mM)  1  dNTP (各10mM)  0.5
        Random 9 mers  0.5  Random 6 mers  0.5
        A-MLV RTase  0.5  M-MLV RTase  0.25
        RNase Inhibitor  0.25  RNase Inhibitor  0.25
        RNase Free dH2O  3.75  RNase Free dH2O  Up to 10
        Total RNA  1  Total RNA  X
        总体积  10  总体积  10

        DRR033A的RT配方居然连镁离子都没有,是不是含在5×M-MLV Buffer中了?这2种体系(其实就是2种逆转录酶)的镁离子浓度差别有多大?能否造成扩增反应的不同?dNTP的量也差了一倍,能相互通用吗?恳请高手们解密!不甚感激!
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