DNA实验技术

一、培养细胞的 DNA 含量的测定 制备单细胞悬液于 200μ l 的 PBS 缓冲液中； 加入 2ml 预冷的 70%乙醇，4℃保存； 附：细胞固定的一般步骤 1. 取单细胞悬液 1～2×106 个细胞于 PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2. 300g 离心 5 分钟，弃上清，反复两次； 3. 重悬细胞于 0.5ml PBS 缓冲液中； 4. 将细胞悬液放置于 2～3ml ...

1. 加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L ，PH=5.2）于 DNA 溶液中充分混匀，使其 最终浓度为 0.3 mol/L； 2. 加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于- 20℃中 15~30 分钟； 3. 12000 g 离心 10 分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴； 4. 加入 1/2 离心管容量的 70％乙醇，12000g 离心 2 分钟，小心移出上清液 ...

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒 DNA可直接用于酶切PCR 扩增。 1. 取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中，4000rpm 离心 1 分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥； 2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100μl 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTApH 8.0，25 mmol/L Tris-HClpH 8.0) 中，剧烈振荡； 3. ...

1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到 EP 管中，称琼脂糖带的重量； 2. 按照每100mg加 400μl 的量加入binding buffer， 放入到EP管振荡器中， 45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要 5 分钟） ； 3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2 分钟，8000rpm 离心1 分钟，弃 EP 管中的液体，将纯化柱放回 EP 管中； ...

1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子； 2. 根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml） ； 3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分 混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固； 4. 室温下 30~ 45 分钟后凝 ...

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的 ...

质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。 一、冻融法 1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中； 2. 加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6）， ...

肿瘤个人化治疗成功与否很大程度上取决于其肿瘤基因的突变类型。在德国一个实验室中，罗氏GS Junior测序系统被用于肿瘤个人化治疗研究中，通过对临床治疗相关的外显子DNA进行测序，鉴定肿瘤组织的基因组突变类型，为后续的抗体治疗药物提供用药指导。

遗传性耳聋是人类听力系统最常见的疾病之一，其中有一部分与X染色体相关。在American Journal of Human Genetics发表的一篇文章中[1]，德国研究人员利用一系列研究方法，包括NimbleGen定制型385K芯片进行序列捕获，从一个西班牙患病家族及一群德国患者的样本中发现了X染色体上一个疾病相关的突变。

限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在5 ...

1. 限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 2. 20μl体积反应体系如下：

染色体制片技术显示染色体一般的形态和结构成功的关键是获得大量染色体缩短适宜的分裂细胞。 1. 压片法 ① 取材：在适当的时间选取细胞分裂旺盛的组织。 ② 预处理：秋水仙素进行活体或离体处理。 ③ 固定：卡诺固定液固定，迅速杀死生活细胞使染色体的组成蛋白变性，保持染色体形态和结构。 ④ 解离：1mol/L HCl60℃进行酸解，不同的材料的酸解时间不同。 ⑤ 染色：改良石炭酸品红染色。 ⑥ 压片染 ...

1. 基化特异性PCR。 甲基化特异性PCR(MSP)是Herman等首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方法。该法是将DNA经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化 ...

早期的基因组DNA甲基化分析技术，如SssI甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已经不能满足现代表观遗传学研究的需求。今年来常用的基因组甲基化的方法有以下两种。

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana1972;Sgaramella和Ehrlich1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。 优点： 1、没有连不上的，只有切不开的。平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能 ...

Immediately before indcution it is advisable to test the culture to determine the fraction of cells that still carry the target plasmid. This involves plating of cells on four different plates. ...

义翘神州2012年年会力作之《光影故事》，生物专业必看！

一、碱变性法提取质粒DNA 质粒(Plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。 分离和纯化质粒DNA的方法很多，但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的裂解； ...

高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Ge ...

随着分子生物技术的发展，科研及临床检测要求的提高，核酸纯化方法也经历了密度梯度离心，酚氯仿、苯酚、异戊醇抽提，二氧化硅吸附等化学物理方法。目前，基于硅胶膜对核酸特异结合的原理所开发的方法已成为核酸纯化的主流方法。为了减少化学、物理因素对核酸的破坏和降解，科学家们力求开发快速、温和的纯化方法，在确保遗传信息的完整性同时，提高工作效率。而KingFisher磁珠纯化法不仅满足了科研工作者对核酸质量的高要求，同时其自动化、通量高、速度快、灵敏度高的特性也提高了科研工作者的工作效率。目前转移磁珠的磁珠纯化方案正在逐步替代以往的各种方法，特别是目前普遍应用的离心柱法。