DNA实验技术

内皮细胞培养至90~100% ↓ PBS洗细胞3遍（室温） ↓ 预热的蛋氨酸和无血清的培养基（MEM）LL nL 50 μM（分子量，383.5，50 mM，25 mg 溶于二甲基硫氧化物DMSO中1304 μl） 在37℃下孵育2小时。 ↓ 等同于（同步）MEM加1.5%BSA+10 μM LLnL50 μM 在37℃下孵育10 ...

一 、组织RNA提取 1. 最好新鲜组织，这样RNA提取的效果比较好，这是肯定的。 2. 如果不是新鲜的（最好在半年之内，-80℃或者液氮中冻存的）组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0~4℃，注意不要拿到常温，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织，称重后，放到预冷的匀浆器中，然后加入一定量的TRIZOL试剂，然后匀浆。注意：速度不要太快，要匀一会挺一会，否 ...

bioanalyzer 到底能干什么？下面的图表会给你一个较为清晰的了解和认识，看来用处还不少呢！bioanalyzer在检测RNA的质量方面绝对是有独到之处的，相信大家看完我所提供的图片就会更加相信这一点的。 bioanalyzer的操作也是非常简单容易的，可以简单的来说上样，点击软件的start，然后40分钟左右看结果。这个时间与你的样本数量和片子类别有关系，通常来说，smallRNA和D ...

一、污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 1. 划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： （1）标本处理区，包括扩增摸板的制备。 （2）PCR扩增区，包括反应液的配制和 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因 （1）标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的 ...

减少引物二聚体的方法 1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法。 2. 可能模板有问题。 3. 模板浓度过小，适当加大模板量。 4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度。 5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷 ...

PCR产物的电泳检测时间一般为48 h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48 h 后带型不规则甚致消失。常见问题如下： 一、假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 ...

目的 探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200 bp 以下的小片段DNA，用于DNA测序。 有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA，所以，先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用，见下图，标本是用的50bp DNA Marker，上一行Marker溶解在纯水里面的，下一行Marker溶解在模拟的PCR反应 ...

RNA探针是一段单链cDNA分子，本文总结了RNA探针的分类、制备方法、探针的纯化、杂交前的注意事项，RAN探针效价的测定以及探针的选择。 RNA 原位杂交中的探针 （一）探针的种类 RNA 探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链 cDNA 或 cRNA 分子。 根据在 RNA 杂交中所使用的探针依其来源可分为三种： 即特异性 cDNA、 cRNA 探针和人工合成寡 ...

RNA标记是将标记物（如放射性同位素、荧光素或酶）共价地连接到RNA，通过检测标记物，进而实现对RNA鉴别和检测的目的。RNA标记在分子探针领域应用广泛，在疾病诊断方面也很有前景。 理想的RNA标记方法应符合以下要求： 1. 操作简单，灵敏度高 2. 不影响碱基配对的特异性 3. 不影响RNA活性 4. 对酶促反应活性无影响或影响不大 ...

1. RNA探针： RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。 （1）孵育时间t = Lf- Lo / K × Lo ×Lf （Lo=核酸探针原长度（kb），Lf=核酸探针水解后所需长度（kb），K是常数率= ...

某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。 为将掺入并结合到cDNA，cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。 乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。 核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的 ...

在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。 1. 酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5'端或3'端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。 2. 体外转录法：体 ...

在RNA的杂交检测实验中，应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果，与DNA 探针相比，检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说，RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。对于通过Northern blots检测低浓度mRNA，以及原位杂交的核酸定位检测等应用，RNA探针是一种理想选择。RNA探针同样也适用于Southern blots， ...

引物延伸分析（primer extension analysis）主要用于mRNA 5′端作图。poly（A）+RNA首先与过量5′端标记的且与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交，然后用反转录酶延伸这个引物。产生的cDNA与RNA模板互补且长度与引物5′端和RNA 5′端之间的距离相等。该法在mRNA 5′端作图方面具有下述优势：一旦引 ...

一、引物延伸分析（primer extension analysis） 引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸 ...

引物延伸实验一些常见问题： 1. 什么是引物延伸实验？ 引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域， 随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到R ...

1. 加入适当体积的RNA（<12 μl）+探头（<3 μl）。 尝试5和10μg 的RNA加600或800页高辛标记的探针。 2. 包括2-3的酵母RNA样品/探针使用。 3. 加入20 μl SOLN。 A到所有涡管（FV =30 μl）和自旋向下。 4. 孵育90-95℃ ...

一、体外转录 在无菌1.5 ml 微型离心管中，结合以下内容： 4 ul 5倍转录缓冲液 2 ul 0.1 M DTT 4 ul 2.5 MM NTP（A，C，G） 0.8 ul RNA酶抑制剂（25 U/ul）RNA酶抑制剂（Promega）中 100 UM冷UTP 1 ul/ug UL线性DNA模板 5 ul10 UCI / UL P32 UTP（800Ci/mmol ...

一、材料准备 4μL5X T4激酶缓冲液 5 μl ATP（7000次/毫摩尔） 10 μl 水+寡核苷酸（200毫微克） 1μlT4激酶 1. 37摄氏度1小时 2. 热失活，在75℃下10分钟。 3. 加入1μl糖原（20毫克/毫升），2μl4M乙 ...