DNA实验技术

相关专题 DNA连接与转化 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如 ...

相关专题 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆(或表达，转化)质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是DNA片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达(如现代基因工程药物的生产)，还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。 DNA连接实验原理： DNA分子的体外 ...

相关专题 DNA连接与转化 目的与原理 转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。 二、材料和方法 1.材料：大肠杆菌 2.仪器： 离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜 3.试剂 ...

相关专题 DNA连接与转化 第一节 概 述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段 然后体外使两者相连接 再用所得到重组质粒转化细菌即可完成。但在实际工作中 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自 ...

相关专题 DNA连接与转化 快速细胞破碎法实验步骤 1、挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8. 2、取1ml菌液至1.5ml eppendorf管中9000rpm离心9min去尽上清. 3、加入70μl Cracking Gel缓冲液20%SDS 10ml 250mmol/L ...

相关专题 DNA连接与转化 实验目的 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义; 学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化子的方法。 实验原理 转化(transformation)是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。 转化混合物中的DN ...

相关专题 DNA连接与转化 一. 概念 1.transformation 特指以质粒DNA或以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。 2.transfection 指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。 3.感受态与致敏过程 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。 二.转化 ...

相关专题 DNA连接与转化 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。 3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但 ...

相关专题 DNA连接与转化 重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过 PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物。 1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于 2ml 含适当抗生素的 LB 培养基中，37℃摇 床培养过夜。 2. 次日取菌液 0.2-0.5ml，13000rpm×3min 离心，弃上清，加入 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 一、 实验目的 学习外源DNA导入原核生物细胞的方法 二、 实验内容 热激处理将外源质粒DNA导入原核细胞。 三、 实验原理 利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便 ...

相关专题 DNA连接与转化 1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条(小于0.6g)捣碎，置于1.5ml离心管中; 2. 加入等体积的Tris-HCl饱和酚(pH 7.6)，振荡混匀; 3. -20℃放置5-10min; 4. 4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中; 5. 加入1/4体积H2O于含胶的离心管 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 连接: 目标片断回收后立即与pGEM-T载体做连接反应。反应体系：2X连接buffer 5μl，回收产物 3μl，T载体 1μl，T4连接酶 1μl，共10μl;混匀，4℃放置16小时以上 转化: 1、从-70℃冰箱中取40μl感受态细胞悬液冰上解冻。 2、 加 ...

相关专题 DNA连接与转化 “选择”(selection)和“筛选”(screening)的基本含义。 选择，是指通过某种外来附加压力(或因素)的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。选择所涉及的范围较为广泛，包括根据克隆载体提供的表型特征的简单选择(simple selection)，和根据突变的互补作用对克隆基因的直接 ...

相关专题 DNA连接与转化 X-gal溶液配制方法 X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。 IPTG溶液配制方法 IPTG为异 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 冻融法质粒DNA转化至大肠杆菌操作步骤 1. 取100μl 感受态细胞于冰浴上融化。 2. 加入1μl 纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。 3. 将菌液放入42℃水浴中热激90 秒，立即放入冰浴中2 min。 4. 加入0.9ml LB液体(提前37℃预热)，于37℃恒温摇床上2 ...

相关专题 DNA连接与转化 什么是标记基因和报告基因?常用的标记基因和报告基因有哪些? 标记基因(marker gene)是一种能够起特异性标记作用的基因。通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。 报告基因(reporter g ...

相关专题 DNA连接与转化 1 基本原理 转基因技术是当今生命科学研究领域最基本的技术。利用转基因技术改变物种的遗传性状从而获得新的品种或产品则是包括基因工程在内的生物技术产业的主要研发内容。 在下面的小实验中我们将通过基因转化的方法把一种对氨苄青霉素敏感的大肠杆菌转化成能抵抗氨苄青霉素的大肠杆菌。其基本原理是:细菌中存在一种环状DNA叫做质 ...

相关专题 DNA连接与转化 SOC培养基 成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌)。 TB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨12g 酵 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程基因工程让一切皆有可能 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。 在这里必须指出的是，处于生物安全考虑，生物工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株由于失去的细胞壁 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 在T2噬菌体侵染大肠杆菌的实验中为什么DNA会留在细菌的细胞里而蛋白质不会?并且噬菌体的DNA是怎样进入细胞的? 噬菌体侵染细菌的过程2009-04-10 12:49(感染阶段 ) 噬菌体侵染寄主细胞的第一步是“吸附”即噬菌体的尾部附着在细菌的细胞壁上然后进行“侵入。先通过溶菌酶的作用在细菌的细胞壁上打开一个缺口 ...