DNA实验技术

核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay，RPA)是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链 ...

The ribonuclease protection assay (RPA) is a highly sensitive and specific method for the detection of mRNA species. The assay was made possible by the discovery and characterization of DNA-dependant ...

Roche公司的RNase Protection Assay (RPA) Using DIG-Labeled RNA Probes下载网址：http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/BIOCHEMI/no1_03/PDF/p22_23.pdf还有一份protocolhttp://www.ualberta.ca/PERINATAL/facilitie ...

RNA酶保护试验((RNase Protection AssayRPA)是通过液相杂交的方式用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2． 由于PC ...

RNA酶保护试验实际上是很早就出现的技术。在1982年出版的第一版圣经（分子克隆）还没有提到。在1989年出版的第二版中已经出现：7.71 Mapping of RNA with Ribonuclease and Radiolabeled RNA(可参见中译本P383-387）。在2001年出版的第三版中的第七章用了大量的篇幅介绍这一技术，可参见科学出版社的第三版中译本P567-577，其中有RN ...

我先说我有的质粒和菌株：PPIC9K，PPIC9，PPICZahphaA，B，C以及一个改造的PPIC9K载体，EcoRI和BamHI双酶切，C末端引入了一个6histag菌株：GS115，KM71，X33，以及十几个空载体对照菌株我的酵母表达Protocol：10ug质粒用Sal线性化，加1/10体积的3M NaAC PH5.2和3倍体积的乙醇沉淀70％乙醇洗一遍，20ul ddH2O重溶按照公 ...

异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。1. 宿主的选择。表达宿主虽众多，但比较常用的也就E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。 E ...

2. 转化子、表达子的筛选转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高手们介绍一下）。但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没有了）。我做的是毕赤酵母(GS11 ...

4. 菌种的保存、退化一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.c ...

摘要：SOD的催化使超氧自由基(O2-)被破坏，并针对氧毒性筑起了第一道防线。SOD的活性及其检测技术与许多不同领域都息息相关，如医药、生化、植物生理、食品工程等。在过去的几十年中，人们已经发现了各种各样的SOD检测方法，但是，这些方法在选择性、检测速度、价格、简便程度上都存在各自的缺陷。最近，我们发现水溶性四唑盐如XTT，WST-1，WST-8适合用于O2-的检测并且也可以被用于SOD的检测。在 ...

1. Inoculate the entire colony in 5 ml YPD culture O.N. or 12 hours2. Dilute into YPA medium (1% yeast extract 2% Bacto-peptone 2%KOAC) to OD600~ 0.2 Vigorous shaking.3. For ts mutants ~15hours at 23C ...

Wash cells with 10 mM Tris pH 8French pressSlow speed spinHigh speed spinResuspend in 10 mM TrisSonicate 2 x 15 sec to remove ß-lacatamasesWash in 10 mM TrisResuspend in 10 mM TrisStore at ?70ºC until ...

最近在做原核表达，包涵体。以前也做过，但经验不多。一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正1. 首先介绍一下背景。载体是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是该公司的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。2. 第一次失败。第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。PCR，酶切都正确。但没 ...

核酸硝酸银染色：参考《锌对缺血再灌注大鼠肝脏金属硫蛋白一1基因表达的影响》营养学报2000年第22卷第4期294-297取PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，所得凝胶进行硝酸银染色．程序如下：(1)于10%乙醇+0.5% 冰醋酸溶液中固定6 min；(2)于10%乙醇+0.5% 冰醋酸溶液中再固定6 min；(3)于0.2 %AgNO3溶液中浸泡10～12 min；(4)用去离子水充分漂 ...

1．电转化感受态细胞的制备 1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照） 2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。 3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4. 将菌液在冰上预冷 ...

近几年来原位分离技术(in situ product removal简称ISPR)在乳酸发酵中的应用引起了世界范围内的广泛关注溶剂萃取发酵法(油酸、叔胺等为萃取剂)、吸附法(离子交换树脂、活性炭、高分子树脂等)、膜法发酵(渗析、电渗析、中空纤维超滤膜、反渗透膜等)等这些方法的使用都是基于在发酵过程中通过从培养介质中及时移走乳酸达到减少产物抑制控制ｐＨ值的目的从而提高原料的利用率和产品产率对于连续过 ...

核酸定量分析 DNA 或 RNA(以260nm处的吸光值为基础) 1. 制备用蒸馏水稀释过的DNA 或 RNA 样品溶液 ( 典型稀释比为 1:100 或 5:500μl) 2. 使用紫外光源在260 nm 处测定吸光值也可以在280 nm 和230 nm 测定吸光值 (260/280 的光吸收值比粗略为2/1；260/230的光吸收值比也应接近 2/1) 3. 计算原液浓度: A260 x 转化 ...

一、问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？答:关于漂移问题：1． 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2． 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3． 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题1． 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2． 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3． 流动相不合 ...

随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 　　迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的 ...

　1.3　环状PCR 　　环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。 　　1.3.1　I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。 I-PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段 ...